枢经推拿对慢性神经病理性疼痛大鼠VGLUT2及炎症因子表达的影响

王雄将，梁英业，卢栋明，唐宏亮，夏 天*

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；3.防城港市中医医院，广西 防城港 538000）

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是由于躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛［1］，因其常引起自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉异常等［2］，传统药物难以彻底消除疼痛，且长期口服药物容易产生各种不良反应［3-4］。推拿产生的刺激由神经传导［5］，本课题组前期研究证实推拿具有较好的镇痛效果，推拿组大鼠经10 d 推拿干预后，细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）水平明显低于L5 脊神经结扎（SNL）造模组，表明推拿可以下调ERK的水平［6-7］。另有研究发现，疼痛的发生和传递可由脊髓背角的ERK通路调控，一旦ERK信号通路被抑制，脊髓背角神经元内囊泡谷氨酸转运体（vesicular glutamate transporters，VGLUTs）的表达水平也明显下降［8-9］。谷氨酸（Glu）作为一种兴奋性神经递质，可以感知、传导和调控外周疼痛信息，与神经病理性疼痛密切相关，VGLUTs 作为Glu 转运体参与Glu 能神经传递过程，与疼痛密切相关［10］；目前已知VGLUTs2型囊泡膜谷氨酸转运体（VGLUT2）表达更为活跃，可通过介导谷氨酸的释放来参与疼痛传导［11-13］。本实验研究枢经推拿对SNL大鼠脊髓背角VGLUT2的影响，为探讨推拿的镇痛机制提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 SPF 级SD 大鼠72 只，雄性，体质量250～300 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004；使用许可证：SYXK（桂）2019-0001。饲养环境：单笼喂养，温度为20～25 ℃，光照时间：8:00～20:00；空气湿度：35%～45%。予自由饮用自来水，饲用普通清洁鼠饲料，保持环境清洁。适应性饲养7 d后进行实验。

1.2 试剂 兔抗鼠VGLUT2（批号：ab217943，英国Abcam）；兔抗p-actin（批号：ab209857，1∶1 000，英国Abcam）；慢病毒HBLV-r-Slc17a6 shRNA1-GFP-PURO［汉恒生物科技（上海）有限公司］。

1.3 仪器 热板痛觉测试仪（型号：Hot Plate Analgesia test；美国IITC Life Science）；von Frey 纤维丝（美国Stoelting）；二氧化碳恒温孵育箱（型号：Form311；美国Forma）；组织包埋机（型号：HistoStar；美国Thermo）；石蜡切片机（型号：RM2135；德国Leica）；酶标仪（型号：1691130A；美国Bio-Rad）；ImageQuant LAS 4000mini凝胶成像系统（型号：ImageQuant LAS 4000mini，美国GE）；电泳仪（型号：powerpad系列；美国Bio-Rad）。

2 方 法

2.1 动物分组与造模 将72 只SD 大鼠随机分为空白组、假手术对照组、SNL 模型组各16 只及慢病毒干扰组、假推拿组、枢经推拿组各8只。参照课题组前期研究的结扎L5 脊神经致神经病理性痛的造模方法［14］，分别对SNL模型组、慢病毒干扰组、假推拿组和枢经推拿组大鼠进行造模处理。按4 ml/kg 体质量给予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，将第6 腰椎脊椎左侧横突分离暴露出来，使用咬骨钳将横突和锥体切断，分离筋膜软组织即可见到两根平行走向的脊神经，将内侧支分离出来并用5-0的缝合线（广州博达医疗用品有限公司）双层结扎，最后缝合皮肤。造模后的大鼠出现术侧后肢外翻状及不敢着地，在无任何刺激的情况下，可以观察到大鼠出现自发性的抬足、跛行、趾间距变窄等现象［15］，再结合大鼠机械痛域及热痛域检测，可以判断SNL 模型是否成功。假手术对照组大鼠参照SNL 造模方法仅找到两根平行走向的脊神经后暴露创面数分钟，并不予分离和结扎脊神经，最后同造模组操作缝合皮肤。

2.2 干预方法 枢经推拿组、假推拿组及慢病毒干预组在造模7 d 后开始干预，空白组、假手术对照组和SNL模型组不进行干预，正常喂养及观察10 d。

2.2.1 枢经推拿组 选用布袋束缚大鼠，暴露大鼠的双后肢。操作仪器为推拿手法模拟仪（专利号：ZL 200710187403.1），选用直径10 mm 的圆形按摩头，手法选用点、拨、揉法；刺激力量为4 N，作用于大鼠双侧环跳、风市、阳陵泉；每种手法每个穴位干预时长为1 min，每只大鼠总计干预18 min，连续干预10 d。

2.2.2 假推拿组 采用大鼠固定器固定假推拿组大鼠，操作人员用手指轻抚大鼠后背，每鼠每日干预18 min，连续10 d。

2.2.3 慢病毒干扰组 参照课题组前期研究［16］，将大鼠麻醉后，定位大鼠两侧髂前上棘，在两点连线的中点作一纵行切口，长约2 cm，充分暴露椎间隙，然后使用22G 针头缓慢插入椎间隙，同时观察该大鼠尾巴是否有摇尾现象，若有，则立即拔出针头，然后将PE-10 导管从椎间隙插入约3 cm，若出现脑脊液从导管流出，即确认注射位置。用微量注射吸取0.5 μl 的慢病毒试剂，从PE-10 导管缓慢注射慢病毒。慢病毒试剂仅注射1次。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 行为学检测 行为学检测包括热痛觉阈值测定、机械痛觉阈值测定和运动功能测定。在造模7 d后分别对空白组、假手术对照组和SNL 模型组进行第一次行为学检测，干预10 d 后对全部组剂进行第二次行为学检测。使用热板痛觉测试仪记录大鼠热痛缩足反应潜伏期（TWL）［17］；使用不同粗细的von-Frey纤维丝刺激大鼠左后足的中央部足底，观察大鼠是否出现缩足反应，以此来记录大鼠的机械性刺激痛阈值［18］；采用斜板实验［7］观测各组大鼠的运动功能情况。行为学检测后均参照课题组前期研究的方法［16］，予过量的10%水合氯醛腹腔注射麻醉对大鼠实施安乐死，腹主动脉采血，收集其脊髓腰膨大段以备用。

2.3.2 免疫组化法检测VGLUT2 表达水平 将大鼠脊髓背角组织使用酒精逐级脱水，透明，浸蜡包埋，切片处理。然后将切片浸入环保型透明液Ⅰ、Ⅱ各30 min进行脱蜡，再用酒精进行水化。先后用3%过氧化氢、EDTA 修复液修复抗原，5%BSA 封闭液在室温下封闭孵育，滴加兔抗鼠VGLUT2（一抗，1∶500）4 ℃过夜。加入二抗37 ℃孵育30 min，依次使用SABC试剂、DAB显色液滴加到组织上显色，苏木素染液复染。最后切片酒精逐级脱水、透明、封片处理。

2.3.3 Western blot 法检测VGLUT2 的表达水平 提取大鼠脊髓背角组织的总蛋白，测定蛋白浓度。电泳分离蛋白质样品（25 μg）后转移至0.45 μm PVDF 膜。将PVDF 膜与一抗在4 ℃下孵育过夜：兔抗鼠VGLUT2（1∶1 000），兔抗p-actin（1∶1 000）；再加入相应的二抗（1∶1 000）孵育1 h。使用BeyoEcl plus发光液进行显影。

2.3.4 ELISA法检测IL-6及TNF-α水平 按照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。

2.3.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，均数间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠干预前后行为学比较

3.1.1 各组大鼠热痛觉阈值比较 见表1。造模7 d 后，与空白组比较，SNL 模型组大鼠热痛觉阈值明显降低（P＜0.05），而假手术对照组无显著差异（P＞0.05）。干预10 d 后，SNL 模型组大鼠热痛觉阈值较空白组明显降低（P＞0.05）；与SNL 模型组比较，假手术对照组、枢经推拿组、慢病毒干扰组大鼠热痛觉阈值显著升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠热痛觉阈值比较 （s，±s）

表1 各组大鼠热痛觉阈值比较 （s，±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与SNL模型组比较，②P＜0.05

组 别空白组SNL模型组假手术对照组假推拿组枢经推拿组慢病毒干扰组n 8 8 8 8 8 8热痛觉阈值造模7 d后5.13±0.79 4.18±0.41①5.56±0.78—____干预10 d后5.56±0.72 3.51±0.40①5.54±0.51②3.72±0.20 5.04±0.62②4.91±0.25②

3.1.2 各组大鼠机械刺激痛阈值比较 见表2。造模7 d 后，与空白组比较，SNL 模型组大鼠机械刺激痛阈值明显降低（P＜0.05），而假手术对照组无显著差异（P＞0.05）。干预10 d 后，SNL 模型组大鼠机械刺激痛阈值较空白组明显降低（P＜0.05）；与SNL 模型组比较，假手术对照组、枢经推拿组、慢病毒干扰组大鼠机械刺激痛阈值显著升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠机械刺激痛阈值比较 （g，±s）

表2 各组大鼠机械刺激痛阈值比较 （g，±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与SNL模型组比较，②P＜0.05

组 别空白组SNL模型组假手术对照组假推拿组枢经推拿组慢病毒干扰组n 8 8 8 8 8 8机械刺激痛阈值造模7 d后51.41±11.65 21.90±4.90①51.79±14.20—— —— ——干预10 d后48.75±12.32 23.25±3.79①52.58±14.97②24.67±5.24 45.54±16.05②51.38±8.32②

3.1.3 各组大鼠运动功能结果 见表3。造模7 d后，与空白组比较，SNL 模型组和假手术对照组大鼠斜板角度显著降低（P＜0.05）。干预10 d 后，各组斜板角度比较无显著性差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠运动功能结果 （度，±s）

表3 各组大鼠运动功能结果 （度，±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05

组 别空白组SNL模型组假手术对照组假推拿组枢经推拿组慢病毒干扰组n 8 8 8 8 8 8斜板角度造模7 d后45.67±1.13 34.31±3.65①35.31±2.32①————干预10 d后45.54±2.43 44.00±3.23 45.86±1.88 43.13±3.29 46.67±2.22 44.88±2.51

3.2 各组大鼠干预前后VGLUT2的表达水平比较

3.2.1 免疫组化结果 见图1、图2 和表4。检测结果显示，VGLUT2 的表达位置为脊髓组织中间带神经元细胞质（浆），表现为棕黄色颗粒，显色的深浅代表的是VGLUT2 表达量的高低。按照免疫组化试剂盒说明书，采用半定量分析法，通过显色深浅将VGLUT2 的蛋白水平分为弱阳性（±）、阳性（+）、较强阳性（++）、强阳性（+++）四个等级。

图1 各组造模7 d后脊髓神经元内VGLUT2免疫组化图

图2 各组干预10 d后脊髓神经元内VGLUT2免疫组化图

表4 各组干预前后脊髓神经元内VGLUT2的表达情况（只）

3.2.2 Western blot检测结果 见图3、图4和表5。

图3 各组造模7 d后脊髓神经元内的VGLUT2表达

图4 各组干预10 d后脊髓神经元内的VGLUT2表达

表5 各组大鼠VGLUT2的蛋白表达量 （±s）

表5 各组大鼠VGLUT2的蛋白表达量 （±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与SNL 模型组比较，②P＜0.05

组 别空白组SNL模型组假手术对照组假推拿组枢经推拿组慢病毒干扰组n 8 8 8 8 8 8灰度比值（VGLUT2/β-actin）造模7 d后0.45±0.12 1.23±0.18①0.82±0.23①②————干预10 d后0.43±0.02 1.18±0.17①0.44±0.14②1.09±0.18 0.45±0.04②0.26±0.11②

表4结果显示，与空白组造模7 d及干预10 d后比较，SNL 模型组大鼠VGLUT2 的蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；干预10 d 后，与SNL 模型组比较，假手术对照组、枢经推拿组及慢病毒干扰组的VGLUT2 的蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。

3.3 各组大鼠血清IL-6及TNF-α水平比较 见表6。与空白组造模7 d 后及干预10 d 后比较，SNL 模型组大鼠血清IL-6及TNF-α水平均显著升高（P＜0.05）；干预10 d 后，与SNL 模型组比较，假手术对照组、枢经推拿组和慢病毒干扰组IL-6 及TNF-α 水平均显著降低（P＜0.05）；枢经推拿组和慢病毒干扰组IL-6及TNF-α的水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表6 各组大鼠血清中IL-6、TNF-α的水平比较 （pg/mg，±s）

表6 各组大鼠血清中IL-6、TNF-α的水平比较 （pg/mg，±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与SNL模型组比较，②P＜0.05；与慢病毒干扰组比较，③P＞0.05

组 别空白组SNL模型组假手术对照组假推拿组枢经推拿组慢病毒干扰组n 8 8 8 8 8 8 IL-6水平造模7 d后30.91±0.57 86.73±5.06①53.46±2.30①②————干预10 d后31.25±0.43 90.59±4.68①46.31±1.96②83.51±1.20 59.06±4.88②③62.14±3.58②TNF-α水平造模7 d后130.75±2.02 206.04±4.27①155.37±8.28①②————干预10 d后129.74±2.18 225.77±5.80①137.55±6.32②202.67±6.56 162.85±4.89②③168.49±4.34②

4 讨 论

中医学认为，疼痛的病因不外乎“不通则痛”及“不荣则痛”。“不通则痛”是外感邪毒、气滞、痰阻、血瘀等致经脉闭阻不通，阴阳之气相搏，气血逆乱，攻冲经脉而出现疼痛；“不荣则痛”是各种原因导致的气、血、阴、阳虚损，使脏腑、经脉失于温煦、滋润、濡养而发生的疼痛。推拿可通过疏通瘀阻、补益气血以达到气血调和、止痛的目的。《黄帝内经》中最早提出“开阖枢”理论，枢之本义为轴，为关键，重点之意。枢经主开合一身气血阴阳，使得气机舒畅。对于气血不通导致的疼痛，枢经推拿通过干预足少阳胆经，可以枢转气机、行气活血，以达通则不痛之功效［19］。其中，经穴阳陵泉为八脉交会穴之筋会，为筋气聚集之所，具有通经活络、舒筋壮骨的效果。环跳穴为胆经腧穴，属足少阳、太阳经交会穴，可同时疏通太阳、少阳两经之气，气行则瘀血消散，通则不痛。风市穴同为胆经腧穴，其解剖位置在坐骨神经干分布区，神经病理性疼痛多以神经干分布区出现疼痛为主，刺激该穴能疏经止痛。故枢经推拿干预足少阳胆经，基于“枢统开阖”之理论，通过枢转表里之气，使气畅血行，全身经络通畅，痛症自除。

NPP 造成的疼痛往往难以有效缓解，有研究表明，NPP 的产生机制包括离子通道的改变、外周敏化、中枢敏化等［20］，研究其疼痛的产生机制有助于指导临床治疗。谷氨酸是一种能感知、传导和调控外周疼痛信息的兴奋性神经递质，参与疼痛信息的传递［21］。当机体受到伤害性刺激后，谷氨酸大量释放并与受体结合，激活相关的离子通道、信号通路，将疼痛信号传入中枢，使得脊髓背角神经元内发生中枢敏化，从而产生痛觉［22］。然而谷氨酸从神经元转运到囊泡膜释放出去，必须要借助特定的转运体［23］，VGLUTs 正是此类转运体蛋白［24］。VGLUTs 有VGLUTs1、VGLUTs2、VGLUTs3 三种，其中广泛存在于神经系统中的VGLUTs1、VGLUTs2 主要转运谷氨酸能神经元。在丘脑中VGLUT2 转运绝大多数的兴奋性突触，在疼痛的产生和维持中起到关键的传递作用［25-26］。

在本项研究中，与空白组比较，假手术对照组大鼠的VGLUT2 表达水平在造模后出现一过性的增高，运动功能明显降低，而IL-6、TNF-α 水平显著升高，但随着大鼠皮肤组织的愈合，其运动功能以及VGLUT2、IL-6、TNF-α 表达水平也基本恢复至正常水平，表明皮肤组织损伤造成的疼痛同样可以使VGLUT2 表达增高，但其持续时间远远短于神经病理性疼痛。造模成功后大鼠的机械刺激痛域、热觉痛域值降低，并出现运动异常，分子生物学检测显示大鼠脊髓背角的VGLUT2 及血清中的IL-6、TNF-α 水平显著上升；在经过10 d 的推拿干预后，模型大鼠的运动功能逐渐恢复，表明脊神经结扎不影响大鼠运动功能，但机械刺激痛域、热痛觉域值仍维持较低水平。慢病毒干扰组大鼠通过鞘内注射慢病毒试剂后，VGLUT2 的表达水平受到靶向抑制，其血清中的IL-6、TNF-α 水平也随之下调，大鼠的疼痛行为学也得到恢复。假推拿组大鼠在经过后背抚摸后，其脊髓背角的VGLUT2 水平表达无明显变化，说明抚摸大鼠后背可能通过其他途径发挥镇痛作用。枢经推拿组大鼠经过推拿干预后，其脊髓背角的VGLUT2 和血清中的IL-6、TNF-α 水平均显著下降，疼痛行为学表现也得到恢复。

本研究证明，枢经推拿可能通过下调VGLUT2 的表达，减少释放炎症因子，从而发挥镇痛作用。