超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法检测牛奶及其制品中恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素残留

张逸雪

（新疆天润生物科技股份有限公司，乌鲁木齐 830002）

奶牛在饲养、产奶过程中，一般需要使用抗生素来预防和治疗奶牛发病，这些药物在使用时，在动物体内吸收率很低，因此会引起奶牛体内、排泄物或牛奶中抗生素残留［1-4］。虽然合理使用抗生素，有助于促进奶牛饲养行业的发展，但残留的抗生素会影响牛奶及其制品的品质，长时间食用牛奶及其制品，如鲜牛乳、酸奶、奶片等，还会对人们的健康造成影响［5，6］。现阶段，尤其是老人和小孩，牛奶及其制品的食用较为常见，食用抗生素残留较多的牛奶及其制品，会对老人的健康和小孩的生长发育造成不良的影响。因此加强对牛奶及其制品中常用抗生素残留的监测，具有重要的现实意义。

近年来，关于牛奶及其制品中抗生素残留的研究报道不多，路杨、王丽英、秦振顺等研究了超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中4 种β-内酰胺类抗生素及其主要代谢产物的分析检测［7］，雍莉、江阳、王艳等研究了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法快速检测牛奶中喹诺酮类抗生素残留的检测方法［8］，现行国家标准中GB 29688−2013《食品安全国家标准牛奶中氯霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，GB 29692−2013《食品安全国家标准牛奶中喹诺酮类药物多残留的测定高效液相色谱法》。研究报道主要对象为牛奶，且检测抗生素的种类单一，不能更好的监控牛奶及其制品中抗生素残留的水平，现行国家标准中，氯霉素采用液质法，喹诺酮类药物，如恩诺沙星，为液相色谱法，与本实验建立的方法比较，检测效率较低，且采用液相色谱法专属性和灵敏度较差。实验建立一种采用全自动加速溶剂提取法将牛奶及其制品中的恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素提取出来，凝胶净化色谱法富集、净化后，上超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪定性、定量检测的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Agilent 1290 infinity 型超高效液相色谱仪；AB Triple Quad ™4000 型三重四级杆串联质谱仪；ASE 300 型加速溶剂提取仪；Sepaths UP 型全自动固相萃取仪；XS-204 型电子分析天平；Millipore Milli-q academic 型超纯水仪；KQ-300GVDA 型台式超声波清洗器；MTN-5800 型自动水浴浓缩仪。

恩诺沙星标准溶液：标物编号为BW1355，浓度为100 μg/mL；头孢拉定标准溶液：标物编号为A11064800AL，浓度为100 μg/mL；阿莫西林标准溶液：标物编号为SB05-100-2008，浓度为100 μg/mL；氯霉素标准溶液：标物编号为SB05-093-2008，浓度为100 μg/mL；均购自某生物科技有限公司。甲醇、乙腈试剂：色谱纯，外购；甲酸、乙酸铵试剂：分析纯，外购；其他试剂：分析纯，外购。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

分离柱：Waters Spherisorb ODS1 色谱柱（100×2.1 mm，1.9 μm）；色谱柱温度：25℃；进样体积：10 μL；流速：0.4 mL/min；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸水溶液（移取1.0 mL 甲酸，加纯化水溶解定容至1 L），洗脱程序：0～1 min 89% A，1～4 min 89%～36% A，4～6 min 36%～8% A，6～8 min 8%A，8～8.5 min 8% ～89% A，8.5～11 min 89% A。

1.2.2 质谱参数

开启三重四级杆串联质谱仪，过夜抽真空，再用调谐液调谐，挑些完毕后，设定质谱参数。质谱参数见表1。

表1 质谱参数

1.3 溶液配制

1.3.1 标准溶液储备液

分别取恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素标准溶液，各准确移取1.0 mL，置4 个棕色容量瓶内，加甲醇定容、摇匀，制得恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素浓度均为10 μg/mL 的储备溶液。

1.3.2 标准曲线系列溶液

取1.3.1 标准溶液储备液，分别准确移取一定量，置棕色容量瓶中，制备含恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素浓度分别为0.01、0.04、0.1、0.4、1.0、6.0 μg/mL 的系列标准曲线溶液，加加甲醇定容、摇匀。

1.3.3 待测溶液制备

液体样品的前处理：取液体牛奶或牛奶制品，精密称取20.0 g，置加速溶剂萃取池中，加硅藻土25.0 g，用玻璃棒将样品与硅藻土拌匀，置全自动加速溶剂萃取仪中，萃取溶剂选择甲醇-乙腈=2∶1（V∶V），按表2 萃取条件进行提取。

固体或半固体样品的前处理：取固体或半固体牛奶或牛奶制品，粉碎机粉碎后，精密称取20.0 g，置加速溶剂萃取池中，加硅藻土25.0 g，混匀后置全自动加速溶剂萃取仪中，萃取溶剂选择甲醇-乙腈=2∶1（V∶V），按表2 萃取条件进行提取。

萃取完毕后，将萃取液取出，置塑料离心管中，低温离心10 min（转速：6000 R/min），上清液转移至GPC 净化瓶中，按下列条件进行净化：溶剂：甲醇-乙酸乙酯（V∶V=1∶1），流速：4.0 mL/min，收集100～420 秒的净化液；取净化液，准确移取10 mL，45℃水浴氮吹至近干，加1 mL 甲醇溶解，涡旋，滤过，即得，萃取条件见表2。

表2 加速溶剂萃取条件

2 结果与讨论

2.1 前处理富集、净化方法的确定

前处理方法中，待测物从牛奶及其制品中被提取后，因牛奶及其制品基质较为复杂，提取液中共提取物较多，因此需要选择合适的富集、净化方法，以期提高检测灵敏度和准确度。常用的富集、净化方法有固相萃取法、凝胶净化色谱法等方法。固相萃取法操作步骤较多，试剂用量大，对环境和实验人员造成影响；凝胶净化色谱法类似于液相色谱分离方法，根据相似相溶原理，将待测目标物从提取液基体中分离出来，净化效果更佳。依据现行版国家标准，GB 29688−2013《食品安全国家标准 牛奶中氯霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》，优化固相萃取条件后，实验分别选用上述两种方法，对加标浓度为0.1 μg/mL 的加标样品进行富集和净化，结果选择凝胶净化色谱法具有最佳的灵敏度和准确度。结果比较见表3。

表3 富集、净化方法比较

2.2 质谱方法的建立

取1.3.1 恩诺沙星标准溶液储备液，用甲醇制备每1 mL溶液中含有恩诺沙星100 ng的检查溶液，上质谱仪检测，设定质谱扫描模式为全扫描模式，即Q1 Scan，得到恩诺沙星母离子峰；根据找到的母离子峰，设定质谱扫描模式为产物离子扫描模式，即Product Scan，得到母离子对应的产物离子；根据产物离子的响应，选择响应较高的2个产物离子，一个作为定量离子，另一个作为定性离子，根据选择的离子对分别进行去簇电压和碰撞动能的优化，建立恩诺沙星MRM 监测方法。同法建立头孢拉定、阿莫西林和氯霉素MRM 监测方法。MRM 监测方法见表4。

表4 MRM 方法

2.3 标准曲线方程、曲线范围和检出限

取1.3.1 标准溶液储备液，分别准确移取一定量，置棕色容量瓶中，制备含恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素浓度分别为0.01、0.04、0.1、0.4、1.0、6.0 μg/mL 的系列标准曲线溶液，加加甲醇定容、摇匀；按1.2 方法设置色谱和质谱仪，稳定后依次进样上述系列标准曲线溶液，采集谱图。以待测物响应值作为纵坐标（Y），以待测物浓度作为横坐标（X）绘制标准曲线，以3 倍信号和噪音比值计算仪器检出限；按2.4 方法配制含恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素最终质量浓度为0.5 μg/kg 的加标溶液，重复测定7 次，以7 次平行测定的标准偏差计算方法检出限。结果见表5，谱图见图1。

表5 标准曲线方程、线性范围及检出限

图1 典型谱图

2.4 加标回收率考察

取牛奶或牛奶制品，分别准确称取20.0 g，置加速溶剂萃取池中，再定量加入1.3.1 恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素标准溶液储备液适量，后续按1.3.3 方法进行后续处理，制备含恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素最终质量浓度依次为0.5、10.0 和300.0 μg/kg 的加标检查溶液，按1.2 方法设置色谱和质谱仪，稳定后依次进样上述加标检查溶液，采集谱图。根据检测结果与加入量折算回收率。结果见表6。

表6 加标回收率考察结果

2.5 方法精密度考察

取牛奶或牛奶制品，分别准确称取20.0 g，置加速溶剂萃取池中，再定量加入1.3.1 恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素标准溶液储备液适量，后续按1.3.3 方法进行后续处理，制备含恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素最终质量浓度为0.05 μg/mL 的精密度检查溶液，按1.2 方法设置色谱和质谱仪，稳定后依次进样上述精密度检查溶液，采集谱图。根据检测结果计算精密度RSD%。结果见表7。

表7 精密度检查结果

2.6 方法应用实例

随机购买市售牛奶及其制品样品，分别按1.3溶液制备方法和GB 29688−2013《食品安全国家标准牛奶中氯霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》国家标准，对样品进行前处理，处理完毕后，按1.2 方法设置色谱和质谱仪，稳定后依次进样上述样品溶液，采集谱图，计算样品中恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素的含量。结果见表8。

表8 典型样品结果

3 结论

实验建立了采用加速溶剂萃取法将牛奶及其制品中的恩诺沙星、头孢拉定、阿莫西林和氯霉素萃取出来，凝胶净化色谱法富集、净化的前处理方法，超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法定性、定量检测的分析方法。实验结果表明，此方法具有自动化程度高、检测结果准确度高等优点，适用于牛奶及其制品中常见抗生素残留的监测。