硒化锌协同真养产碱杆菌的杂化光合系统研究

冯渝骅， 姜 雷， 许梦莹，3， TREMBLAY Pier-Luc，2， 张 甜，2，3，4，5*

(1.武汉理工大学化学化工与生命科学学院， 武汉 430070； 2. 武汉理工大学三亚科教创新园， 海南 三亚 572024；3.武汉理工大学绍兴高等研究所， 浙江 绍兴 312300； 4.武汉理工大学硅酸盐建筑材料国家重点实验室， 武汉 430070；5.武汉理工大学材料科学与工程学院， 武汉 430070)

作为一种绿色环保的能源获取方式，光催化材料自20世纪70年代由日本学者Fujishima发现并报导后[1]，受到全世界学者的关注.ZnSe作为一种半导体材料有着合适的禁带宽度2.69 eV[2]，能够吸收可见光并产生光生电子—空穴对，将水中的H+还原为H2，并有许多学者对此进行了研究和报导[3-5].硒化锌制备通常以操作简单的水热法制得[5-6]，且相比石墨相氮化碳有着更窄的禁带宽度[7]，而禁带宽度更为优秀的硫化镉中含有的镉元素被认为是对人体肾脏有极大危害性的重金属元素[8]，硒化锌相比之下具有更好的生物相容性[9-10].因此，硒化锌作为一种半导体光催化材料有着很大的发展前景.然而光催化材料只能将水还原为氢气或进行污染物降解[2，6，11]，也有学者对光电催化还原二氧化碳进行了研究，但是总体的效率仍然偏低[12].生物发酵可以在温和的条件下大量获得对人有利用价值的有机物[13-14]，近年有学者提出，将光催化材料与微生物发酵系统相结合，将光催化材料作为无法直接利用太阳能的微生物和阳光之间的能量桥梁，提升微生物发酵产物获取量[15]，并且有学者将光电化学与Spromusaovata2662相结合，达到提升其乙酸产量的目的，并将该系统称为“人工光合系统”[16]，还有学者通过将光催化材料与RalstoniaeutrophaH16相结合，提升了发酵系统的聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的积累量[17-19]，这种生物杂化光合系统能够充分利用太阳光获得多碳有机物，并且整个过程绿色环保，是一个十分有潜力的研究方向.本次研究选用RalstoniaeutrophaH16作为生物杂化光合系统的发酵菌株，通过ZnSe和R.eutrophaH16共同构成生物杂化光合系统，用于提升PHB的产量.

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用试剂均未经过进一步纯化，未特殊说明均来自国药化学试剂有限公司，分析纯.具体使用试剂如下：氯化铵，硫酸钾，七水合硫酸镁，二水合磷酸二氢钠，十二水合磷酸氢二钠，二水合氯化钙，七水合硫酸亚铁，七水合硫酸锌，一水合硫酸锰，盐酸(信阳市化学试剂厂，分析纯)，大豆蛋白胨(上海源叶生物科技有限公司，分析纯)，胰蛋白胨(Sigma-Aldrich 试剂有限公司，分析纯)，氯化钠，磷酸氢二钾，浓硫酸(信阳市化学试剂厂，分析纯)，氯仿，甲醇，75%乙醇(武汉兴和达商贸有限公司，75±5%)，高纯氮气(武汉同合气体有限公司，99.999%)，氢氧化钠，六水合硝酸锌，硼氢化钠，硒粉，二次蒸馏水，果糖(北京兰杰柯科技有限公司，99%)，抗坏血酸.

1.2 分析仪器

气相色谱仪GC 9720，浙江福立分析仪器股份有限公司；气相色谱仪GC 9790plus，浙江福立分析仪器股份有限公司，高效液相色谱仪Breeze 2，Waters公司，美国；S-4800扫描电子显微镜，日立公司，日本；JEM-1011型透射电子显微镜，日本电子株式社会，日本；D8 ADVANCE粉末X射线衍射仪，Bruker公司，美国；UV 2550紫外可见光分光光度计，岛津公司，日本.

1.3 ZnSe合成方法

称取4 g NaOH溶解于100 mL水中，取25 mL配置好的NaOH溶液溶解1 g NaBH4，称取2.087 g 硒粉置于三口烧瓶，并加入10 mL配置好的NaOH，密封后通入氮气30 min，后将NaBH4溶液加入三口烧瓶，搅拌至硒粉完全溶解，称取7.864 g六水合硝酸锌，加入100 mL聚四氟乙烯内衬中，并向其中加入45 mL NaOH溶液以及含硒前驱液，混匀后放入反应釜中，在恒温干燥箱中200 ℃反应24 h，自然冷却后离心，取沉淀，用二次蒸馏水水洗至中性，在恒温干燥箱中避光干燥24 h，得到成品ZnSe.

1.4 Ralstonia eutropha H16培养方法

在-80℃冰箱中取出冻存的RalstoniaeutrophaH16(北纳生物)，用接种环接种在加了5 mL TSB培养基试管中，TSB培养基各组份为17 g·L-1胰蛋白胨，3 g·L-1大豆蛋白胨，5 g·L-1NaCl，2.5 g·L-1K￣HPO￣4.在恒温摇床(ZWY-2102C，上海智城分析仪器制造有限公司)中以30 ℃，200 r·min-1，培养24 h后取5 μL菌液，接种于含5 mL氮源限制培养基的试管中[20]，培养基各组份为1 g·L-1NH4Cl， 5.2 g·L-1Na2HPO4·2H2O，11.6 g·L-1Na2HPO4·12H2O，0.45 g·L-1K2SO4，0.8 g·L-1MgSO4·7H2O，0.082 g·L-1CaCl2·2H2O，1 mL·L-1微量元素溶液，20 g·L-1果糖，微量元素溶液成分为15 g·L-1FeSO4·7H2O，2.4 g·L-1MnSO4·H2O，2.4 g·L-1ZnSO4·7H2O，0.48 g·L-1CuSO4·5H2O，0.1 mol·L-1HCl.在恒温摇床中培养至D(600)(600 nm波长下光吸收度)值为1，取50 μL菌液接种至加有不同ZnSe的氮源限制培养基中，在光照培养箱(GZL-P280D，合肥斯卡特生物科技有限公司)中在30 ℃，200 r·min-1下培养120 h，并对不同时间点的细菌PHB含量，培养基果糖浓度进行测试.

1.5 ZnSe产氢实验方法

在总体积为120 mL的玻璃瓶中加入20 mg 合成的ZnSe材料，并加入0.4 mol·L-1的抗坏血酸[1]，以厌氧橡皮塞密封后通入纯氮气30 min，随后超声5 min，在500 W 氙灯太阳光模拟器(PL-XQ500W，北京普林塞斯科技有限公司)下进行光照，滤光片为波长大于420 nm.循环实验在每次测试后鼓气40 min，其余条件同上.

1.6 PHB测定方法

取4 mL菌液，以10 000×g相对离心力离心，收集沉淀，加入1.96 mL甲醇，0.04 mL浓硫酸，2 mL氯仿，在恒温干燥箱中100 ℃反应4 h，冷却后加1 mL 二次蒸馏水，振荡萃取，取下清液，用气相色谱仪进行测试，色谱柱为RB-FFAP.

1.7 果糖浓度测试方法

取1 mL菌液，以10 000×g相对离心力离心，收集上清液，用高效液相色谱仪，视差检测器进行测试，流动相为0.005 mol·L-1H2SO4，柱温为50 ℃.

1.8 细胞干重占比，收率，量子效率的计算

取培养120 h后的4 mL菌液，离心后取沉淀，在恒温干燥箱中干燥至衡重，记录细胞干重质量，收集到的PHB质量比上细胞干重的值记为PHB在细胞干重中的占比CDW%.收率计算公式(1)如下：

Y=cPHB(g·L-1)/c果糖下降(g·L-1)× 100%，

(1)

其中，Y为果糖转化为PHB的收率.量子效率计算通过假设系统中额外产生的PHB均来自光催化材料为细菌提供的额外还原当量，计算额外产生的PHB所需的电子数与光激发电子数之间比值得到量子效率[17]，具体见反应式(2)～(3)及公式(4)：

Acetoacetyl-CoA+NADPH+H+=

(R)-hydroxybutyryl-CoA+NADP+，

(2)

NADP++2e-+2H+=NADPH+H+，

(3)

量子效率=2×

(额外生成的PHB所需电子数)/光激发电子数×

100%.

(4)

2 结果与讨论

2.1 ZnSe光催化材料的表征

2.1.1 ZnSe材料的XRD表征 通过XRD表征可以观察到，该水热法合成的硒化锌是经典的闪锌矿结构是立方晶系面心晶格结构，空间群号为216号，4个峰对应的出峰角度和对应晶面分别为27.2°(1 1 1)晶面，45.2°(2 2 0)晶面，53.6°(3 1 1)晶面和65.9°(4 0 0)晶面，对应的标准JCPDS号为37-1463，图1为ZnSe的XRD表征结果.

图1 ZnSe X射线衍射表征

2.1.2 ZnSe材料的UV-Vis表征 由于紫外光对微生物有很大的伤害，因此需要光催化材料在可见光范围内也能够工作.通过对样品进行200～800 nm范围的UV-Vis表征测试，图2(a)为ZnSe的UV-Vis表征结果，可以得到ZnSe的最大吸收波长为460 nm，说明该材料可以在可见光波长范围内工作，符合该次实验的要求.通过Kubelka-Munk公式对光吸收图谱进行归一化换算，换算公式如下：

(F(R)·hυ)2=A·(hυ-Eg)，

(3)

其中，F(R)，hυ，A和Eg分别为Kubelka-Munk变量，能量子，仪器常数和禁带宽度.图2(b)为换算图.从图中斜率最大处做切线，可以得到该次实验合成的ZnSe禁带宽度约为2.52 eV，大于光催化水分解所需的1.23 eV[2]，结合图2(a)的结果，可以说明材料能够在可见光范围内光催化分解水产氢.

图2 ZnSe的UV-Vis图谱及归一化公式计算图

2.1.3 ZnSe材料的SEM表征，TEM表征 材料的SEM表征结果见图3(a)和图3(b)，TEM表征结果见图3(c).可以观察到材料呈不规则块状颗粒，有明显的团聚现象，颗粒的粒径在150～400 nm之间.粒径不均匀的可能原因在于反应过程全程在水相溶液中进行，没有加入有机试剂进行分散，且反应过程为静置反应，会出现颗粒结晶聚集的情况.

图3 ZnSe半导体材料的形貌

2.2 ZnSe半导体光催化产氢实验

该次实验首先对ZnSe在可见光范围内光催化水分解产氢的性能进行了研究，对比添加牺牲剂和不添加牺牲剂光照1 h的产氢量，结果如图4(a)所示，可以发现ZnSe在不添加牺牲剂的情况下并未测出氢气的产生，在添加抗坏血酸作为电子牺牲剂时，得到了2.39 mmol·g-1·h-1的氢气生成速率.这是由于抗坏血酸作为电子牺牲剂所需要的氧化能级相比O2-更低，因此更容易被氧化，填补光生空穴的电子空缺[21]，具体的过程表示如式(4)所示：

(4)

其中，AA为抗坏血酸，h·为光生空穴，DHA为脱氢抗坏血酸，e-为光生电子.

实验还对ZnSe材料连续光催化产氢进行了测试，结果如图4(b)所示，在3 h的产氢测试中，每1 h对氢气的含量进行测试，第1、2、3 h的氢气产生量分别为2.39、6.03、7.55 mmol·g-1·h-1，在1 h至2 h之间，此时由于连续光照，反应器的温度上升，增强了反应活性，因此使得氢气的产量高于第1 h时的氢气含量.

在ZnSe的循环性能测试中，对其进行了3 h 3次循环实验，结果如图4(c)所示.在第3次循环的3 h氢气产生量为3.03 mmol·g-1·h-1，相比第1次循环3 h的6.03 mmol·g-1·h-1有明显的下降，是第1次循环3 h时的50.3%，这是由于材料中的Se2-被氧化，催化剂的活性逐渐下降.

图4 ZnSe 光催化产氢测试结果

2.3 光照对ZnSe生物杂化光合系统的影响

该次实验将ZnSe与RalstoniaeutrophaH16进行异养生长混合培养，并测量了120 h培养中PHB的积累量变化曲线图5.通过对比未加入ZnSe的光照/黑暗组和加入1 g·L-1ZnSe的光照/黑暗组，可以发现，在所有实验组中，R.eutropha均在72至96 h时快速在体内积累PHB，在96 h处达到最高值，并在120 h后趋于稳定.在96 h时1 g·L-1ZnSe光照和黑暗组PHB浓度为1.82 g·L-1和0.81 g·L-1，未加材料的光照和黑暗组分别为0.98 g·L-1和0.78 g·L-1，说明当没有加入光催化材料时，R.eutropha不能直接利用可见光促进自身的代谢积累PHB，当加入材料而不光照时，光催化材料本身也对R.eutropha积累PHB没有影响，只有当整个系统同时满足光照并加入光催化材料时，R.eutropha才能利用光能促进自身积累PHB.在长达120 h的培养实验中，1 g·L-1材料光照组在72 h时开始有明显的提升，并且保持与其他组的差距，说明材料在该系统中保持着长时间的稳定性，通过结合ZnSe材料的催化剂失活机理，可以推测，在系统中有可以充当电子牺牲剂的物质存在，并能够使光生电子与材料快速分离，使得ZnSe能够一直保持稳定.该次合成的ZnSe适用于与R.eutropha共同构建生物光合杂化系统，对该系统生物发酵有明显的提升作用.已经有学者对相关的机理进行了一定的研究[17-19]，在光催化材料与微生物构成的生物杂化光合系统中，光催化剂在光照时产生光生电子和氢气等还原当量会通过微生物细胞表面，进入细胞体内，并显著提高微生物体内的NADPH/NADP+的水平，而NADPH作为R.ertrophaH16在代谢积累还原PHB的过程中起到充当电子供体的作用，因此，光催化材料通过提供外源电子的方式可以显著提高PHB在微生物中的积累量.

图5 不同材料光照条件下R.eutropha异养生长120 h PHB累积浓度曲线

2.4 ZnSe浓度对生物杂化光合系统的影响

为了得到最佳的材料浓度，该次实验还对不同浓度ZnSe对R.eutropha代谢积累PHB的影响进行了实验.对0.3～3 g·L-1ZnSe组异养培养120 h后的PHB含量进行测试，结果如图6所示，在与未加材料光照组的结果比较中可以看到，0.3 g·L-1ZnSe材料对系统并没有明显的影响，随着ZnSe浓度的不断升高，PHB在细菌体内的积累量也逐渐升高，在1 g·L-1时达到最高，此时PHB的积累量为1.70 g·L-1，相比未加材料光照组的0.91 g·L-1提升约1.87倍，当材料浓度继续上升时，R.eutropha对PHB的积累量也逐渐下降，但材料浓度增加至3 g·L-1时，仍能得到1.46 g·L-1的PHB产量，系统中PHB产量下降是因为当材料浓度过大时，材料无法充分利用光能，细菌也无法充分与材料相结合.因此说明该系统中ZnSe的最佳浓度为1 g·L-1，当材料浓度上升至最佳浓度的3倍仍然对系统有着促进作用，说明该材料有着优异的生物相容性.

图6 120 h后不同ZnSe含量PHB积累量

2.5 系统效率的计算

通过对细胞干重(cell dry weight， CDW)，果糖转化PHB收率和量子效率的计算可以得到表1，其中PHB的量子效率计算以在8 690 lx光强下，未加入材料的R.eutrophaH16异养生长120 h后得到的PHB产量为空白值，其余实验组在相同条件下得到的PHB减去空白值得到的额外PHB产量被认为是由光子经光催化剂转化为细菌可以利用的形式进入细菌体内转化产生.从表1中可以看到，随着ZnSe浓度不断上升，CDW从20%提升至35%，随后逐渐下降至32%.果糖的消耗量见图7，总体上随着材料的加入，果糖的消耗量也随之上升，但除0.3 g·L-1以外，其余材料浓度的果糖对PHB的转化率都高于未加材料组，最高可达到18%，说明在该系统中，材料可以促进细菌利用果糖并将果糖转化为PHB.在量子效率的计算中，1 g·L-1ZnSe实验组的量子效率可以达到19%，说明光子转化为微生物积累PHB所利用的还原当量的效率比较高.

图7 不同ZnSe浓度组120 h果糖消耗量

表1 PHB细胞干重占比，果糖转化收率和量子效率

3 结论

通过水热法合成的ZnSe颗粒粒径在200 nm至400 nm之间，且禁带宽度为2.52 eV，属于可见光范围能够进行光催化水分解的光催化材料，在单纯材料产氢的测试中，加入牺牲剂以后有2.39 mmol·g-1·h-1的氢气产生速率，但是在循环实验中表现出材料的稳定性不佳，但是通过与R.eutropha的结合，构筑生物光合杂化系统后可以明显提升R.eutropha的PHB积累量，在本次实验中，ZnSe的最佳浓度为1 g·L-1，此时得到1.82 g·L-1的PHB积累量，是空白对照组的1.87倍.在ZnSe浓度增加后系统的PHB产量仍比未加材料组高，说明材料有良好的生物相容性.ZnSe对R.eutropha的促进作用通过提升细菌利用果糖的力能和将果糖转化为PHB的能力上，具体表现为加材料组的CWD高于未加材料组，果糖转化PHB收率也高于未加材料组，且1 g·L-1ZnSe时系统的量子效率达到最高，此次研究旨在通过一种绿色环保的且低成本方式提升微生物发酵系统的效率和产物产量.