桉树枝瘿姬小蜂胚胎发育及胚后发育

关月姗, 朱方丽,2, 杨仪韩, 曹惠怡, 严玉宁, 王兴民,*

(1. 华南农业大学植物保护学院昆虫系, 生物防治教育部工程研究中心, 广州 510642; 2. 常州市房屋安全和白蚁防治指导中心,江苏常州 213000; 3. 青海高等职业技术学院农业与资源环境系, 青海海东 810700)

桉树枝瘿姬小蜂Leptocybeinvasa隶属膜翅目(Hymenoptera)小蜂总科(Chalcidoidea)姬小蜂科 (Eulophidae)，于2004年确定为新属新种(Mendel, 2004)，该蜂最早发现于中东、地中海一带，2012年前后，已在亚、欧、美三大洲超过26个国家都有分布(Arzone and Alma, 2000; Viggianietal., 2002; Aytar, 2003, 2006; Ramadan, 2004; Brancoetal., 2006; Nyekoetal., 2007; Udagedara and Karunaratne, 2014; Vanegas-Ricoetal., 2015)。2007年首次在我国广西东兴县发现该蜂，当时普查结果显示广西的发生面积已达2 000 hm2，在之后几年里，该蜂扩散到广东、福建、海南，并向内陆省份扩散(唐超等, 2008; 伍荔霞, 2008; 吴耀军等, 2009; 魏初奖等, 2017)。桉树枝瘿姬小蜂在我国华南地区一年发生4～5代，世代重叠(吴耀军等, 2010; 罗基同等, 2011; 邱焕秀等, 2011; 朱方丽等, 2013)。危害桉属树木的嫩枝，在嫩茎、叶柄、叶脉处产生虫瘿。严重侵染可导致叶、枝变形，树木生长迟缓，在新植桉林和苗圃地危害严重(姚贤宇等, 2016; 肖银波等, 2018)。在我国，其主要危害的桉树种类有赤桉Eucalyptusldulensis、巨桉E.grandis、尾赤桉E.urophylla、邓恩桉E.dunnii、窿缘桉E.exserta和多利桉E.dorrigoensis等(武海卫等, 2009; 常润磊等, 2010; 韦建林等, 2013; 张开存等, 2017)。黄梦伊等(2020)基于MaxEnt对桉树枝瘿姬小蜂在中国发生趋势进行预测：高、中度适生区面积分别为141.12万和82.56万km2，分别占我国内陆国土的14.7%和8.6%。该蜂对广泛应用于造纸、园林绿化、生态防护林(郑嘉琪和陈少雄, 2017)的桉树林造成严重危害，导致较大的经济损失。

近年来，我国学者对该蜂的生物学及生态学特性、监测防控等多方面进行了深入研究，以求为有效防控该蜂提供更多的基础数据(谷平等, 2012)。但关于该蜂的胚胎发育及胚后发育方面，国内外研究报道较少。Marzo(2008)研究表明，桉树枝瘿姬小蜂的卵具有卵柄，且在生殖系统内具有两个生殖粘腺，但关于该蜂的卵在孵化过程中的变化(胚胎发育过程)尚未报道。在该蜂的胚后发育方面，Mendel等(2004)根据虫瘿发育过程中的主要特征划分为5个发育阶段，分别为虫瘿呈圆球形绿色且相互独立、虫瘿呈典型的肿块型、虫瘿表面颜色逐渐变为粉红色、进一步呈现浅红色或暗红色和虫瘿表面出现羽化孔，但尚未对各发育阶段的虫瘿、虫室、虫体的体型大小变化进行深入研究。本研究观察了桉树枝瘿姬小蜂的胚胎发育以及虫瘿、虫室、虫体三者间相对应的发育过程，以期更深入地了解桉树枝瘿姬小蜂及虫瘿的生物学特性，为其发生为害规律方面提供一定信息。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫及寄主植物

桉树枝瘿姬小蜂种群饲养于寄主植物尾赤桉Eucalyptusurophylla×Eucalyptuscamaldulensis。尾赤桉苗高约为50 cm，生长在华南农业大学植物保护学院网室内。

1.2 桉树枝瘿姬小蜂雌性生殖系统解剖

将桉树枝瘿姬小蜂雌成虫放入Ringer氏生理盐水(氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠以及磷酸二氢钠)，在体式镜(Leica M10)下解剖，取雌性生殖系统，移至显微镜(Olympus-BX51，配置联机数码相机CoolSNAP-Pro Version 4.1配套图像摄取和分析软件，日本奥林巴斯公司)下进行拍摄。

1.3 桉树枝瘿姬小蜂胚胎发育观察

选取生长良好的尾赤桉树苗枝条嫩尖进行套袋，每枝头接种桉树枝瘿姬小蜂雌成蜂3～5头，3 h后将成蜂赶离，将树苗置于26℃恒温箱中培养。每隔6 h随机选取部分枝条嫩尖在体式镜(Leica M10)下进行解剖，取出卵并在显微镜(Olympus-BX51，配置联机数码相机CoolSNAP-Pro Version 4.1配套图像摄取和分析软件，日本奥林巴斯公司)下放大拍摄(400×)。

1.4 桉树枝瘿姬小蜂胚后发育指标测定

待1.3节中的尾赤桉苗接种培养10 d，选取30个虫瘿或30头幼虫在体式镜(Leica M10)下进行解剖观察，并在带有数码照相机(Axiocan HRc)的体视镜(SteREO Discovery V20， Zeiss)下拍摄记录虫瘿、虫室及桉树枝瘿姬小蜂幼体的发育状况，此后每隔5 d进行一次同样操作。其中虫瘿需要记录表面特征和虫瘿直径变化；虫室需要记录薄壁层的出现时间、厚度变化及虫室直径变化；桉树枝瘿姬小蜂幼体则需要记录幼虫特征及直径变化，直至发育到蛹。虫瘿、幼体、虫室的体积计算采用椭球体积计算方法。椭球体积计算公式如下：

式中，a,b,c分别代表供测物(虫瘿、幼体、虫室)的中心点沿x,y,z轴上的半径，图1示供测物(虫室)的体积测量方法，虫瘿及幼体的测量方法相同。

图1 供测物(虫室)的体积测量Fig. 1 Measurements of the volume of object (chamber)

1.5 数据分析

数据采用SPSS 13.0分析处理，用Duncan氏复极差法检验(DMRT)对数据差异进行多重比较分析，并用软件Excel制作图表。

2 结果

2.1 桉树枝瘿姬小蜂胚胎发育

2.1.1桉树枝瘿姬小蜂雌性生殖系统：桉树枝瘿姬小蜂雌性生殖系统由生殖器、受精囊、卵巢和一对输卵管粘腺组成(图2: A)。初产的卵具有较长的卵柄，且前端呈乳头状(图2: B)。

图2 桉树枝瘿姬小蜂雌性生殖系统及卵Fig. 2 Female reproductive system and eggof Leptocybe invasaA: 雌性生殖系统Female reproductive system; B: 卵Egg.

2.1.2桉树枝瘿姬小蜂胚胎发育：桉树枝瘿姬小蜂胚胎发育如图3所示。结果表明，雌成虫在植物组织内产卵12 h后，卵并没有出现明显变化(图3: A)；24 h，卵柄内的营养物质开始向卵聚集，卵柄末端开始出现空白(图3: B)；36 h，卵开始逐渐分为两层，胚胎层出现(图3: C)；48-64 h，可见营养物质继续向卵头部位聚集且具明显的细胞分裂(图3: D)；72-84 h，卵完整地分为两层，外层为卵壳，内层为胚胎，且内部细胞明显(图3: E, F)；96-108 h，卵内细胞逐渐淡化(图3: G, H)；直至114 h，幼虫逐渐成形，且第一次明显观察到幼虫在卵内活动，此时卵柄部位已被完全吸收(图3: I)；132 h，卵内幼虫仍有活动，且在卵头的顶部出现一孵化孔(图3: J)；138 h，部分卵开始孵化，幼虫出现(图3: K)。当刚孵化的幼虫静止时，其呈白色球形，而当其活动时，可观察到幼虫的头和尾，但两者间相距很近。

图3 桉树枝瘿姬小蜂胚胎发育Fig. 3 Embryonic development of Leptocybe invasaA: 产卵后12 h (12 h after egg laying); B: 产卵后24 h (24 h after egg laying); C: 产卵后36 h (36 h after egg laying); D: 产卵后48-64 h (48-64 h after egg laying); E: 产卵后72 h (72 h after egg laying); F: 产卵后84 h (84 h after egg laying); G: 产卵后96 h (96 h after egg laying); H: 产卵后108 h (108 h after egg laying); I-J: 产卵后114-132 h (114-132 h after egg laying); K: 产卵后138 h (138 h after egg laying).

2.2 桉树枝瘿姬小蜂胚后发育

桉树枝瘿姬小蜂胚后发育过程如图4所示。桉树枝瘿姬小蜂幼虫呈乳白色，随着发育时间的延长，虫体直径不断增大(图4: A-F)；桉树枝瘿姬小蜂的蛹，初期呈乳白色，后逐渐呈成虫体型，背部有黄色物质出现，复眼突出(图4: G)；当发育到50 d，蛹的体色变暗，且两只复眼和3只单眼呈红色(图4: H)；直至发育到55 d，蛹发育到后期，呈黑色且虫体各个部位特征明显(图4: I)。桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体长约1.1～1.4 mm，腹部末端钝圆，触角无刺毛；雄成虫体长约0.8～1.1 mm，腹部末端稍尖，生殖器外露，触角具有刺毛(图4: J-K)。桉树枝瘿姬小蜂幼虫体积随着发育时间的延长逐渐增大，且幼虫体积间存在显著性差异(F=52.72,df1=6,df2=173,P<0.0001)(表1)。桉树枝瘿姬小蜂幼虫体积在不同发育阶段，其增长速度间存在显著性差异(F=16.86,df1=5,df2=12,P<0.0001)(图5)。桉树枝瘿姬小蜂幼虫体积增长速率随发育时间的延长逐渐增大；至30 d，幼虫体积增长速率最大，后逐渐放缓，至40 d,增长速率降低为0，幼虫发育到蛹。

图4 桉树枝瘿姬小蜂胚后发育Fig. 4 Postembryonic development of Leptocybe invasaA: 10 d; B: 15 d; C: 20 d; D: 25 d; E: 30 d; F: 35-40 d; G: 45 d; H: 50 d; I-J: 55 d; K: 雌成虫Female adult; L: 雄成虫Male adult.

表1 桉树枝瘿姬小蜂虫瘿、虫室和幼体的体积Table 1 Volume of galls, chambers and larvaeof Leptocybe invasa

图5 桉树枝瘿姬小蜂幼虫体积的增长速率Fig. 5 Increase rate of larval volumeof Leptocybe invasa折线图上不同字母(平均值±标准误)表示差异显著(P<0.05, Duncan氏复极差法检验)。图8同。Data (mean±SE) followed by different letters in the line chart are significantly different (P<0.05, Duncan’s multiple range test). The same for Fig. 8.

桉树枝瘿姬小蜂幼虫以寄主植物为食，其取食部位为虫瘿内的薄壁组织。当幼虫刚孵化时，其被包裹在柔嫩的植物组织内(图7: A)；接种20 d，虫室开始逐步分化成两层，外层逐步栓化变硬，而靠近幼虫的内层则变成肉质的薄壁细胞层，为幼虫提供食物(图7: B-F)；幼虫发育到末龄时，薄壁细胞层消失，仅剩下内壁光滑且栓化的虫室外层(图7: G-H)。薄壁层作为桉树枝瘿姬小蜂幼虫的食物来源，其厚度随虫瘿日龄的变化而变化(F=13.56,df1=5,df2=185,P<0.0001)(图8)，接种25 d后厚度趋于最大，45 d时基本消失。

图7 桉树枝瘿姬小蜂虫室发育过程Fig. 7 Developmental process of chambersof Leptocybe invasaA: 10 d; B: 15 d; C: 20 d; D: 25 d; E: 30 d; F: 35 d; G: 40 d; H: 45 d.

图8 桉树枝瘿姬小蜂虫瘿内的薄壁细胞层厚度随虫瘿日龄的变化Fig. 8 Changes of the thickness of parenchyma celllayer in Leptocybe invasa galls with the age of gall

2.3 寄主植物组织受害症状的变化过程

桉树枝瘿姬小蜂虫瘿的发育历程如图6所示。桉树枝瘿姬小蜂雌成虫产卵后，其产卵部位出现植物的渗出液，1 h，呈现黑色疤痕(图6: A)；前10 d，虫瘿形态无明显变化(图6: B)；至15 d，虫瘿开始膨大，且疤痕开始逐渐脱落，此时的虫瘿呈绿色或淡红色(图6: C, D)；25 d，疤痕已完全脱落，此时的虫瘿呈现红色且具有光泽(图6: E)；30-50 d，虫瘿体积逐步增大，且颜色由红色逐渐变为深红色，而虫瘿表面的光泽亦逐渐褪去(图6: F-I)；55 d，桉树枝瘿姬小蜂成虫羽化，虫瘿表面出现羽化孔(图6: J)。桉树枝瘿姬小蜂的虫瘿体积随生长发育时间的延长而增大，在不同发育阶段间虫瘿体积存在显著性差异(F=37.25,df1=8,df2=289,P<0.0001)(表1)，50 d时虫瘿体积约是第10天的16倍。

图6 桉树枝瘿姬小蜂虫瘿发育过程Fig. 6 Developmental process of Leptocybe invasa gallsA: 1-5 d; B: 10 d; C: 15 d; D: 20 d; E: 25 d; F: 30 d; G: 35 d; H: 40 d; I: 45-50 d; J: 55 d.

3 结论及讨论

26℃恒温条件下，桉树枝瘿姬小蜂完成胚胎发育约需138 h，整个过程可分3个阶段：产卵后24 h为营养物质聚集期，36-84 h为胚胎期，96-138 h为孵化期(图3)。桉树枝瘿姬小蜂在虫瘿内完成发育，其发育过程与虫瘿发育过程保持一致。当桉树枝瘿姬小蜂若虫发育到末期或蛹期时，内部虫室和外部虫瘿均不再膨大。桉树枝瘿姬小蜂幼虫体积增长速率随发育时间呈现单峰型，即在30 d时，其增长速率达到最大(图5)。刺桐姬小蜂虫瘿发育情况与桉树枝瘿姬小蜂虫瘿基本相似(邓晓韶等, 2009; 汪少妃等, 2015)。

桉树枝瘿姬小蜂以虫瘿内的髓(薄壁细胞)为食物，因此其发育进程与薄壁层厚度存在一定关系。虫瘿内薄壁层厚度随时间变化呈现抛物线状，其前期增长较快，后期下降变缓。25 d时，薄壁层厚度达到最大，此时桉树枝瘿姬小蜂幼虫处于低龄阶段，其取食量较小；之后随着幼虫取食量的增大，薄壁层厚度不再增大，而呈现缓慢下降的趋势，直至幼虫化蛹前，髓部被完全取食(图8)。刺桐姬小蜂幼虫也是以髓为食料，其虫瘿中的薄壁层第Ⅲ阶段显著加厚(邓晓韶, 2009; 汪少妃等, 2015)。

研究刺桐姬小蜂虫瘿的学者将其分为瘿室(活动层)、薄壁层(营养层)、内核(保护层)和周围组织(表皮层)(邓晓韶, 2009; 汪少妃等, 2015)。本研究通过解剖将桉树枝瘿姬小蜂虫瘿分为3个基本层，最外层为膨大的表皮层，该层包括植物原有的维管束层、皮层和表皮等结构；中间层为栓化层，该层主要其支撑作用，后期呈现白色栓化；内层为薄壁细胞层，也称髓，是桉树枝瘿姬小蜂幼虫取食的部位；而内部的空腔就是幼虫栖身的地方。这与吴耀军等(2012)的描述基本一致。

本研究观察了桉树枝瘿姬小蜂的胚胎发育以及虫瘿、虫室、虫体三者间相对应的发育(胚后发育)过程，为深入了解该害虫的生物学特征和发生为害规律提供一定的基础信息。