亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与脂代谢和肝脏脂肪含量的关系▲

刘景慧 黄国秀 伍朝春 庞 羽 黄定贵 李发添

(广西壮族自治区人民医院健康管理中心，广西南宁市 530021)

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是蛋氨酸循环的关键酶，可催化5，10-亚甲基四氢叶酸形成5-甲基四氢叶酸，从而在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)向蛋氨酸转化中起重要作用；而MTHFR基因突变后可使MTHFR活性下降，导致血Hcy水平升高，进而促进多种疾病的发生和发展[1]。目前研究发现MTHFR基因C677T位点多态性与多种代谢性疾病和血管性疾病相关[2]。动物实验表明，MTHFR基因突变与肝脂肪变性和肝损害有关[3]。本研究选取广西南宁市壮汉族居民，探讨MTHFR基因C677T位点多态性的特点及其与脂代谢、肝脏脂肪含量[受控衰减参数(controlled attenuation parameter，CAP)]的相关性，为本地区居民代谢性疾病的全面健康管理提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2020年6月至2021年1月在我院进行健康体检且体检资料完整的238例体检者的相关资料。纳入标准：(1)户籍所在地为广西南宁市且长期居住广西南宁市者，民族为壮族或汉族；(2)体检资料完整者，包括MTHFR基因分型、肝脏CAP、身高、体重、血压、Hcy水平等检测项目。排除标准：严重肝肾功能和甲状腺功能异常、酒精性肝病、病毒性肝炎、恶性肿瘤、免疫性疾病等患者。其中男性156例、女性82例，年龄30～66(47.36±11.36)岁。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料的收集：收集研究对象的性别、年龄、血压、身高、体重、腰围、臀围，计算体质指数。体质指数=体重(kg)/身高2(m2)。

1.2.2 生化指标的检测：抽取研究对象空腹12 h以上的静脉血6～8 mL，其中2 mL全血用于检测血沉，检测方法为魏氏法。剩余的血标本以3 500 r/min离心后获取血清，使用日立7600型全自动生化分析仪检测Hcy、血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、空腹血糖、空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、尿酸水平，采用质谱法检测维生素D2、维生素D3水平。

1.2.3 肝脏脂肪含量的检测：使用法国Echosens公司的FibroScan520型肝功能剪切波量化超声诊断仪，检测患者空腹状态下的CAP水平，以评估肝脏脂肪含量，CAP水平≥238 dB/m提示肝脏脂肪含量≥11%，诊断为脂肪肝。

1.2.4 MTHFR基因型的检测：采集1.5 mL全血，采用乙二胺四乙酸抗凝后，采用MTHFR基因677C/T检测试剂盒(PCR-荧光探针法；深圳泰乐德医疗有限公司；生产批号：20200102、20200605、20200902)提取DNA。(1)提取方法。取25 μL全血样本放于1.5 mL离心管内，加入试剂盒内R1沉淀剂150 μL振荡混匀，室温放置5 min。将离心管转移至X1B型高速离心机(Thermo Scientific公司)，14 000 r/min离心2 min，弃上清，保留沉淀；加入R2洗液150 μL于上述离心管内，振荡以确保沉淀悬浮，4 ℃下14 000 r/min离心 1 min，弃上清，保留沉淀；加入R3裂解液50 μL，振荡以确保沉淀脱离管底，65 ℃干浴5 min；加入R4稳定剂15 μL振荡混匀，短暂离心使溶液集中于管底。选取4 μL DNA模板用于实时荧光定量PCR，剩余样本置于-20 ℃保存。(2)检测方法。应用等位基因特异PCR结合TaqMan荧光探针检测法进行基因分型检测，试剂为MTHFR基因677C/T检测试剂盒，仪器为LightCycler 480型实时荧光定量PCR仪(Roche Instrument Center AG)。PCR反应条件为50 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45个循环。于60 ℃下收集荧光信号，根据FAM通道和VIC通道所形成的扩增曲线判断基因型。

1.3 分组方法 根据MTHFR基因型检测结果对研究对象进行分组，其中携带MTHFR基因C677T位点CC基因型者为野生组(n=144)，携带CT基因型或TT基因型者为突变组(n=94)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。应用Kolmogorov-Smirnov法进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M(P25，P75)]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验；采用多因素Logistic回归模型分析影响MTHFR基因突变的相关因素。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象的MTHFR基因C677T位点多态性及两组研究对象的基线资料比较 238例研究对象中，携带MTHFR基因C677T位点CC基因型、CT基因型、TT基因型各144例(60.5%)、81例(34.0%)、13例(5.5%)。突变组和野生组研究对象的性别构成、年龄、腰围、臀围、体质指数、收缩压和舒张压比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 两组研究对象基线资料的比较

2.2 两组研究对象相关指标水平的比较 与野生组相比，突变组研究对象的血清Hcy、FINS、三酰甘油水平较高，HDL-C水平较低(均P<0.05)；两组研究对象的ACE、血沉、空腹血糖、尿酸、LDL-C、维生素D2、维生素D3水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。野生组与突变组的脂肪肝检出率分别为45.83%和54.26%，其中突变组的检出率稍高，但两组差异无统计学意义，两组的肝脏CAP值差异亦无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 两组研究对象相关指标的比较

组别nHDL-C(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)尿酸(x±s,μmol/L)维生素D2(x±s,nmol/L)维生素D3(x±s,nmol/L)CAP(x±s,dB/m)脂肪肝(n)是/否突变组941.29±0.243.32±0.93376.92±97.572.99±0.9756.78±18.43265.46±45.5851/43野生组1441.47±0.433.37±0.66361.62±99.963.14±1.0859.59±20.55257.10±53.1566/78 t/z/χ2值3.6980.2490.6371.0901.0731.2531.614P值<0.0010.8040.5270.2770.2840.2110.204

2.3 与MTHFR基因突变相关的因素 以MTHFR基因突变情况作为因变量(野生组=0，突变组=1)，将单因素分析中差异具有统计学意义的变量(Hcy、HDL-C、FINS、三酰甘油水平)作为自变量(均以实际值纳入)，采用多因素Logistic回归模型进行分析。结果显示，Hcy、HDL-C水平为MTHFR基因突变的独立影响因素(均P<0.05)。见表3。

表3 与MTHFR基因突变相关的因素分析结果

3 讨 论

目前已发现MTHFR基因存在多种突变，突变的常见位点有C677T、A1298C、G1793A和T1317C等，以C677T突变最为常见且研究较为深入[2，4]。MTHFR基因C677T位点具有多态性，存在CC型(野生型)、CT型(杂合变异型)和TT型(纯合变异型)3种基因型。不同种族、地域、生活环境、性别人群的突变特点有所不同。MTHFR基因C677T位点CC、CT和TT基因型分布频率在欧洲波兰男性人群中分别为47.0%、43.0%、10.0%，在女性人群中分别为49.0%、42.0%、9.0%[5]；在北京地区男性人群中分别为23.3%、50.5%、26.2%；在女性人群中分别为22.7%、49.4%、27.9%[6]；在广西红水河流域壮族长寿老人中分别为65.5%、29.3%、5.2%[4]。本研究以广西南宁市壮汉族居民为研究对象，结果显示其MTHFR基因C677T位点的突变率较高，其中MTHFR CC基因型频率为60.5%，MTHFR CT基因型频率为34.0%，MTHFR TT基因型频率为5.5%。MTHFR基因C677T位点突变可影响酶的活性，导致MTHFR酶的耐热性下降，使叶酸代谢障碍，Hcy水平随之升高，引发一系列疾病[1]。研究显示，MTHFR基因C677T位点的多态性与多种疾病如血管性疾病、代谢性疾病、神经精神性疾病，甚至肿瘤等的发生和发展有关[7-10]。近年来还有学者发现，MTHFR基因C677T位点的多态性或可作为预测新型冠状病毒肺炎发病、病情严重程度的生物遗传标志物[11]。因此MTHFR基因C677T位点多态性对人群健康的影响涉及面较广，值得进一步研究。

高Hcy水平和血脂异常被认为是心血管疾病发病的独立危险因素[1，12]。本研究结果显示，与携带MTHFR基因C677T位点CC基因型相比，携带CT或TT基因型人群的血清Hcy、FINS、三酰甘油水平增高，HDL-C水平降低(均P<0.05)。Logistic回归分析结果显示，血清Hcy和HDL-C水平与MTHFR基因C677T位点突变相关(均P<0.05)。国内外的研究证实，MTHFR基因C677T位点多态性与Hcy、叶酸和血脂水平有交互作用[7，13]。动物实验[13]表明血Hcy与血脂水平相关联的机制为，当Hcy水平升高到210.0 μmol/L时，可降低循环HDL、载脂蛋白AⅠ和大HDL颗粒的浓度，抑制HDL功能，并促进HDL-C的清除；当Hcy水平在0.5～2.0 mmol/L时，小鼠原代肝细胞中载脂蛋白AⅠ 的合成分泌减少。然而，关于不同病种和不同性别人群中MTHFR基因C677T位点突变与血脂水平的相关性，目前尚未有统一定论。如在高血压患者中MTHFR基因C677T 位点多态性与血脂异常无关联，各基因型携带者总胆固醇、三酰甘油、HDL-C及LDL-C水平无明显差异[8，14]。在广西红水河流域的长寿老人中，女性变异型(CT/TT)基因携带者的总胆固醇、三酰甘油及LDL水平明显高于野生型(CC)基因携带者；而男性3种基因型间的各血脂水平未见有明显差异[4]。另外，埃及学者还发现，MTHFR基因C677T多态性增加了具有阿拉伯种族遗传背景人群的肥胖易感性，可能有助于肥胖的发展[15]。本研究纳入的研究对象为广西南宁市的壮汉族人群，结果显示MTHFR基因C677T位点多态性与HDL-C水平有关，但与体质指数、血压、血糖、尿酸、三酰甘油、LDL-C等指标水平无关，这可能提示在广西壮汉族人群中MTHFR基因突变对除HDL-C以外的其他代谢性指标异常无易感性。但本研究的样本量不够大，可能影响研究结果的可靠性，今后需扩大样本量进一步研究验证。

此外，关于MTHFR基因C677T位点多态性与非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)之间的关系的研究结论并不确切。早前我国学者研究证实了MTHFR基因C677T位点多态性是NAFLD的遗传性危险因素[16]。但更多的研究否认了类似关联，认为MTHFR基因C677T位点多态性与NAFLD的发生风险无关[17-18]。本研究亦未发现野生组及突变组之间的肝脏脂肪含量和脂肪肝检出率存在差异，而肝脏脂肪含量与NAFLD密切相关，今后将纳入NAFLD人群进行分析，以进一步评估该基因突变与NAFLD的关系。

综上所述，MTHFR基因C677T位点突变可伴随脂代谢紊乱，但对肝脏脂肪含量无明显影响。如能针对我国不同地域不同民族人群开展MTHFR基因筛查，同时联合检测Hcy水平，或可协助判断血Hcy水平升高的原因，有助于临床对高Hcy血症和血脂异常的评价和治疗，为慢病管理提供新的思路。