五味子乙素对4℃保存后猪精子质量和获能状态的影响

谢运法，许春荣，胡传活*，陈志英，冯 妮，刘德玉，唐荣福，李美珍，唐胤晟，汪燕玲，黄明光

（1.广西大学动物科技学院，广西南宁 530004；2.广西畜禽品种改良站，广西南宁 530001；3.广西畜牧研究所，广西南宁 530001）

公猪精液保存主要有常温保存（15～17℃）、低温保存（4℃）、超低温保存（-196℃），其中，常温保存因为代谢快，有害代谢产物堆积，内源性细菌容易滋生等诸多因素，不利于精液的长期保存，又因猪精子质膜富含不饱和脂肪酸和特殊的膜结构，对冷刺激敏感；超低温保存目前无法用于规模化生产，而低温条件下精子处于半休眠状态，活性氧（ROS）和有害代谢产物减少，内源性细菌滋生受到抑制，这些条件使得低温保存研究具有较高的实际意义。

精子在阴道要经过一系列变化才能与卵子结合形成受精卵，而此变化为获能。Green 等研究发现，当精子温度降低至5～15℃时，会发生类似于获能反应的“获能样”变化，而精子发生获能是一个极其复杂的过程，与ROS、Ca、HCO、pH等诸多因素有关，其中Ca和ROS 浓度变化是引起精子发生获能的关键指标。

五味子乙素（SchB）作为一种天然的抗氧化剂，不仅有增强细胞抗氧化能力的功能，还具有抑制细胞内Ca浓度的作用。本实验研究在冷藏基础液中添加SchB 对4℃保存后猪精子质量及获能状态的影响，为猪精液低温保存技术的完善提供一定的理论和科学依据。

1 材料与方法

1.1 猪精液采集 采集广西科达畜禽改良有限责任公司8 头体况相近杜洛克种公猪精液，各取25 mL 后进行实验。

1.2 主要试剂与溶液配制 SchB（有效含量≥98%）购自维克奇生物科技公司；总抗氧化能力（T-AOC）、考马斯蓝R250、FLuo-3AM 钙离子、乳酸、DNA 损伤（AO）、线粒体膜电位（MMP）检测试剂盒购自索莱宝生物公司；其他试剂均为国产优级纯。SchB 以二甲基亚砜（DMSO）为稀释液，稀释后4℃保存。

精子冷藏基础液：首先用分析天平准确称量：葡萄糖3 g、蔗糖4 g 置于事先消毒的烧杯中，加入适量的纯化水水浴加热溶解。取出冷却至室温，准确称取青霉素0.06 g、庆大霉素0.048 g 加到广口瓶中，待全部溶解后用0.22 μm 过滤器过滤，加入经过12 000 r/min离心20 min 的卵黄上清液20 mL，定容至100 mL。4℃保存，并在12 h 内使用。冷藏基础液配制参照文献。

1.3 主要仪器 液晶显示器显微镜购自深圳泰宇星光电仪器有限公司；电子车载冰箱、电子冷暖箱购自北京福意联电器有限公司；冰箱购自河南新飞电器有限公司；恒温水浴锅购自上海精宏有限公司；低温超速离心仪购自美国Sigma 公司；多功能酶标仪购自瑞士TCAN INFIEF PLEX 公司；精子分析仪购自法国卡苏公司。

1.4 精液冷藏 精液稀释后，23～25℃条件下暗处静置平衡0.5 h，数层纱布包裹后放入电子冷暖箱中于17℃条件下平衡2 h，最后再次包裹数层纱布放入4℃冰箱中保存，并且每隔6 h 轻轻晃动1 次。

1.5 实验分组 根据在冷藏基础液中添加不同浓度的SchB 将精液分为6 组，分别为0、2.5、5、10、20、40 μmol/L 组，0 μmol/L 组为对照组，冷藏1 d 后对精子活力、顶体完整率、质膜完整率、畸形率、平均运动速率、摆动性、DNA 损伤、MMP、T-AOC、Ca含量、乳酸含量进行检测，试验重复3 次。

1.6 精子质量检测

1.6.1 精子活力的检测 按照文献所述方法，取20 μL冷藏后精液滴于37℃恒温板上预热的载玻片上，400 倍镜下观察精子活力（以精子作直线运动百分比为标准），每组取3 个视野，重复3 次。

1.6.2 精子顶体完整率的检测 用考马斯亮蓝检测精子顶体的完整性，取100 μL 精液于3.7%多聚甲醛中固定10 min，PBS 洗涤1 次，加100 μL 的PBS 制成悬液，混匀后取10 μL 制成涂片，自然晾干。把风干后的载玻片于装有考马斯亮蓝的染色缸中染色，自来水轻轻冲洗，置于染色架上自然晾干。在400 倍光学显微镜下观察顶体完整性（顶体完整的精子头部染成均匀的蓝色，表面光滑，轮廓清晰），每次至少计数200 个精子，重复3 次。

1.6.3 精子质膜完整率的检测 取100 μL 冷藏后精液于果糖-柠檬酸钠低渗溶液中，调整精子密度到1×10～2×10个/mL，37℃条件下孵育30 min，取20 μL 混合液于载玻片上，盖上盖玻片，于400 倍光学显微镜下观察精子弯尾率，重复3 次。

1.6.4 精子畸形率、平均运动速率、摆动性的检测 取20 μL 精液于载玻片上，盖上盖玻片，用精子分析仪对冷藏后精子畸形率、平均运动速率、摆动性进行检测，重复3 次。

1.6.5 精子MMP 的检测 调整精子密度到1×10～2×10个/mL，于1 mL 的PBS 中900 r/min 离心10 min，弃上清，重复3 次。根据线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行操作，多功能酶标仪检测各组荧光值，重复3 次。

1.6.6 精子DNA 损伤的检测 根据检测说明书在避光的条件下进行操作，染色涂片后在400 倍荧光显微镜下进行观察（染成黄绿色荧光为正常精子的细胞核，绿色颗粒状则为DNA 损伤细胞核），至少计数200 个精子，重复3 次。

1.6.7 精子T-AOC 的检测 取冷藏后精液用PBS 洗涤3次后收集精子沉淀，放于冰盒之中，用超声破碎精子，然后于低温离心机上，10 000 r/min 离心5 min，取上清检测蛋白浓度，按照检测说明书检测精子T-AOC。

1.6.8 精子冷藏后Ca的检测 分别取1 mL 各组精液，用PBS 缓冲液900 r/min 离心10 min，弃上清，重复3 次。根据索莱宝Ca检测试剂盒说明书进行操作，荧光酶标仪检测各组荧光值，重复3 次。

1.6.9 精子获能水平的检测 根据参考文献的试验结论，精子获能的主要产物是乳酸，乳酸含量越多精子获能的程度越大，据此设计本实验。取冷藏后精子用PBS洗涤3 次后收集精子沉淀，放于冰盒之中，用超声破碎精子，然后于低温离心机上8 000 r/min 离心10 min，取上清检测蛋白浓度，根据乳酸试剂盒说明书进行操作，多功能酶标仪检测各组数值，重复3 次。

1.7 统计分析 试验数据采用 Excel 2007、SPSS 26.0软件进行统计分析，Graphpad Prism 5.0 软件绘图，采用检验和单因素方差分析处理数据，以平均值±标准误表示，<0.05 表示差异显著，>0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 SchB 对冷藏后精子活力、顶体完整率、质膜完整率的影响 由表1、图1 可知，10 μmol/L SchB 组的精子活力显著高于其他组（<0.05），2.5、5 μmol/L SchB组的顶体完整率和质膜完整率高于对照组和40 μmol/L组（<0.05），低于10 μmol/L 组（<0.05）。

表1 SchB 对冷藏后精子活力、顶体完整率、质膜完整率影响的影响

图1 SchB 对冷藏后精子质膜、顶体完整率的影响

2.2 SchB 对冷藏后精子畸形率、平均运动速率、摆动性的影响 由表2 可知，5 μmol/L SchB 组的精子畸形率低于对照组和2.5、20、40 μmol/L SchB 组（<0.05），高于10 μmol/L SchB 组（<0.05）。5、10 μmol/L SchB组的精子平均运动速率高于对照组、2.5、20、40 μmol/L SchB 组（<0.05）。10 μmol/L SchB 组精子摆动性显著高于其他组（<0.05）。

表2 SchB 对冷藏后精子畸形率、平均运动速率、摆动性的影响

2.3 SchB 对冷藏后精子MMP、T-AOC、DNA 损伤的影响 由表3 和图2 可知，对照组、20、40 μmol/L SchB组MMP 高于2.5、5 μmol/L SchB 组（<0.05），但低于10 μmol/L SchB 组（<0.05）。5 μmol/L SchB 组的T-AOC 高于对照组、2.5、20、40 μmol/L SchB 组（<0.05），低 于10 μmol/L SchB 组（<0.05）。在SchB 浓度达到10 μmol/L 前，冷藏后精子DNA 损伤率随SchB 浓度升高而降低，当SchB 浓度到达5 μmol/L时达到显著差异，当浓度到达10 μmol/L 时差异最为显著（<0.05）。

表3 SchB 对冷藏后精子MMP、T-AOC、DNA 损伤的影响

图2 SchB 对冷藏后精子DNA 损伤的检测

2.4 SchB 对冷藏后精子Ca、乳酸含量的影响 由表4可知，冷藏后精子内Ca浓度呈现随SchB 的浓度升高而降低的趋势，且SchB 浓度达到5 μmol/L 时与对照组比较Ca浓度降低（<0.05）。

表4 SchB 对冷藏后精子Ca2+浓度、乳酸含量的影响

3 讨 论

3.1 SchB 对冷藏后猪精子表观指标的影响 在猪精液保存过程中，抑制精子过度氧化一直都是猪精子冷藏研究的热点，五味子乙素作为一种强有力的抗氧化剂在大鼠心脏、肝脏等器官保存中取得了良好的成效，但是在猪精液的冷藏中尚无人研究。在精子的保存过程中精子的活力、顶体完整率、质膜完整率、畸形率、平均运动速率、摆动性、MMP、DNA 损伤、T-AOC 是评定精子质量的重要指标。Hirano 等研究发现，精子的直线速率和曲线速率与其受精率呈正相关，而精子活力又与精子的直线速率和曲线速率呈正相关。He 等研究发现，精子质膜的完整性对精子的新陈代谢、受精、获能都有十分重要的意义。本实验结果表明，在精液冷藏基础液中添加适量的SchB 对精子的活力、顶体完整率、质膜完整率、平均运动速率、摆动性、MMP 都起到积极作用，且最适浓度10 μmol/L，但过量添加会降低公猪精液品质。

活性氧（ROS）是精子氧化过程中的重要产物，ROS 含量过多容易导致精子DNA 损伤，畸形率上升，活力下降从而影响动物繁殖能力。本试验结果表明，在冷藏基础液中添加适量的SchB 可以提高精子的总抗氧化能力，降低精子DNA 的损伤以及畸形精子的产生，当添加量为10 μmol/L 时效果最为显著，但添加过量时会起到相反的作用。

3.2 SchB 对冷藏后猪精子获能情况的影响 研究发现，Ca通过参与环磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）的信号通路引起精子获能，其作用机理为Ca达到阈值后激活可溶性腺苷酸环化酶（sAC）合成cAMP，cAMP 浓度达到阈值后便会激活PKA，最终依靠PKA 的活性来调控精子获能情况，精子获能后会出现超活化现象，其膜的通透性发生变化，能量代谢速率以及运动速度都会大幅度加强，获能后的精子无法长时间保存，因此抑制精子保存过程中获能的发生，也是提高冷藏后精子质量的途径。Carrageta 等研究发现，精子获能过程中能量代谢的主要产物是乳酸，因此精子乳酸含量也是评定精子获能情况的重要指标。本实验结果表明，在冷藏基础液中添加SchB 可以降低精子内Ca和乳酸浓度，但是在降低Ca浓度时最适浓度不是10 μmol/L，很可能的原因是当浓度超过10 μmol/L时，精子质量降低导致所测得Ca浓度偏低。

4 结 论

本试验结果表明，在冷藏基础液中添加10 μmol/L SchB 可以显著提高冷藏后精子的质量，并且可以降低冷藏过程中精子的被动获能。