微小RNA-425调控重组人Dickkopf相关蛋白3对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响

宁金卓 程 帆 余伟民 饶 婷 李浩勇 阮 远

武汉大学人民医院泌尿外科 湖北 武汉 430060

膀胱癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，是世界范围内最常见的第6种癌症，其死亡率位于癌症第9位［1］。近年来，膀胱癌的发病率和死亡率呈快速上升趋势，其复发率高，侵袭性和迁移能力强，导致 预 后 不 理 想［2，3］。微 小RNA（microRNAs，miRNAs）是一系列全长20～24个核苷酸的内源性非编码RNA，可与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）互补结合后负性调控靶基因的表达［4］。miR-425是近年来发现的miRNAs家族中的一个重要分子，大量的研究表明miR-425与多种恶性肿瘤的发生发展过程密切相关。本实验旨在研究miR-425表达下调后对膀胱癌生物学行为的影响，并进一步探讨miR-425是否通过重组人Dickkopf相关蛋白3（Dickkopfrelated protein 3，DKK3）来实现其作用。

1 材料与方法

1.1 材料选取2017年1月—2019年8月武汉大学人民医院泌尿外科接受经尿道膀胱肿瘤电切术及膀胱癌根治性切除手术的32例膀胱癌组织及癌旁正常组织。患者术前签署同意书并收集相关临床资料，所有方案均经武汉大学人民医院伦理委员会批准。膀胱癌T 24细胞购自美国ATCC公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；TRIzol、Lipofectamine 2000试剂购自购自美国ThermoFisher公司；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡试剂盒购自上海碧云天生物公司；Transwell购自美国Corning公司；重组人Dickkopf相关蛋白3（DKK3）抗体购自Abcam公司。

1.2 细胞培养及转染膀胱癌T 24细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃、5%CO2。细胞接种于6孔板中，待细胞密度至70%～80%，采用无血清的培养基同步化24 h，按照Lipofectamine 2000说明书操作进行转染，实验组转染miR-425 inhibitor，对照组转染NC inhibitor，进行后续的实验分析。

1.3 逆转录聚合酶链反应（q RT-PCR）实验组织和细胞中总RNA的提取按照TRIzol说明书进行，反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Green试剂盒和ABI 7900仪器，qRT-PCR法检测miR-425和DKK3的表达。采用2-ΔΔCt法计算miR-425和DKK 3的相对表达量。

1.4 蛋白质印迹法（Western Blot）实验收集细胞后BCA法检测蛋白浓度，采用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、转膜、封闭后加入DKK3抗体，于4℃冰箱孵育过夜。GAPDH为内参对照，加入相应羊抗鼠二抗在室温下孵育1 h，洗膜后ECL发光液显影，ImageJ软件分析条带的灰度值。

1.5 荧光素酶报告实验利用生物信息预测网站预测miR-425和DKK3的结合片段。将T 24细胞以1×105细胞/孔接种到24孔板中。构建DKK 3 3'-UTR荧光素酶报告载体，按说明书将上述载体、NC inhibitor及miR-425 inhibitor载体转染至T 24细胞，使用荧光素酶报告分析荧光素酶活性。

1.6 细胞凋亡实验将转染的细胞胰酶消化后离心并充分洗涤，重悬于70%预冷乙醇中。按照试剂盒说明书进行，PBS缓冲液重悬细胞加入AnnexinⅤ-FITC混匀。静置后加入碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）于37℃下避光孵育1 h，采用流式细胞仪进行分析。

1.7 细胞划痕实验细胞转染后使用无胎牛血清培养基培养24 h，用20μL枪头形成划痕，洗去脱落细胞后拍照并记录划痕宽度。培养箱培养24 h后再次显微镜下拍照并记录划痕宽度。依细胞愈合相对距离判断细胞运动能力。

1.8 细胞迁移和侵袭实验转染后24 h细胞用无血清培养基接种于上室，将含有10%血清的新鲜培养基加入下室。孵育48 h后用0.1%结晶紫固定和染色30 min，染色结束后洗脱残余结晶紫溶液，棉签擦去基质胶和小室内的细胞，在显微镜下拍照计数。

1.9 统计学分析应用SPSS 20.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织中miR-425的表达水平与膀胱癌患者临床特征的相关性根据miR-425在膀胱癌组织标本中的平均表达量，将入选患者分为miR-425高表达组（15例）和低表达组（17例）。采用χ2检验分析miR-425的表达水平与临床病理特征的相关性，结果提示：miR-425的表达与肿瘤的组织学分级和肿瘤直径密切相关，而与患者的年龄、性别无统计学相关性（表1）。

表1 miR-425表达水平与膀胱癌患者临床特征的相关性

2.2 miR-425在膀胱癌及癌旁正常组织中的表达qRT-PCR结果显示膀胱癌及癌旁正常组织中miR-425 mRNA表 达 量 分 别 为（4.29±0.32）、（1.32±0.21）。与癌旁组织相比，miR-425的表达在膀胱癌组织中表达显著增加，差异有统计学意义（t=43.895，P＜0.05）。

2.3 miR-425靶向调控DKK 3表达本研究通过使用microrna.org软件预测DKK3是miR-425的下游靶点。miR-425 inhibitor转染的T 24细胞中，DKK 3-WT表达水平明显增加，而DKK3-MUT荧光素酶活性无明显变化，上述结果表明miR-425可直接负性调节DKK3的表达；Western Blot法检测转染miR-425 inhibitor后DKK 3的蛋白表达水平。结果显示，与对照组DKK 3蛋白表达水平（0.23±0.04）比较，miR-425 inhibitor组DKK3蛋白表达水平（0.72±0.06）明显增加，差异有统计学意义（t=11.769，P＜0.05）（图1A）；qRT-PCR法检测转染miR-425 inhibitor后DKK 3的mRNA表达水平。结果显示，与对照组DKK3表达水平（1.00±0.18）比较，miR-425 inhibitor组DKK3表达水平（3.21±0.25）明显增加，差异有统计学意义（t=12.426，P＜0.05）（图1B）。

图1 miR-425在膀胱癌细胞中调控DKK 3的表达

2.4 miR-425在膀胱癌细胞中对细胞凋亡、迁移及侵袭的影响结果显示，两组凋亡率分别为（10.70±1.34）%、（25.20±1.89）%。与其对照组相比，miR-425 inhibitor组凋亡水平显著增加，差异有统计学意义（t=10.840，P＜0.05）（图2A）；划痕实验数据显示，miR-425 inhibitor组较其对照组相比，膀胱癌T 24细胞的迁移能力明显下降（图2B）；采用Transwell实验测定细胞迁移及侵袭水平的改变，两组迁移数分别为（86.05±8.49）、（57.63±5.96）个，侵袭数分别为（41.23±4.12）、（15.03±2.13）个。结果显示miR-425 inhibitor组较其对照组相比，细胞的迁移及侵袭能力显著下降，差异有统计学意义（t=-4.745，P＜0.05和t=-9.784，P＜0.05）（图2C）。

图2 miR-425在膀胱癌细胞中对细胞凋亡、迁移及侵袭的影响

3 讨论

膀胱癌的病理过程较为复杂，与吸烟、遗传和环境等多种因素相关，是一个多阶段及多途径改变的发展过程［5］。据统计，约80%的膀胱癌患者为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），大多数患者通过早期的诊断和治疗，其5年生存率可超过90%。然而，50%～70%的NMIBC患者易复发，10%～20%的病例可能迅速发展为肌层浸润性膀胱癌（MIBC）［6］。MIBC患者通常伴有盆腔淋巴结转移或远处转移，5年生存率可降低到50%［7］。miR-425基因定位于3号染色体，具有高度的保守性［8］。已有报道显示miR-425通过调控SCAI的表达促进肝癌的侵袭和转移［9］；Liu等［10］研究发现miR-425通过PI3K-Akt途径负性调节IGF-1的表达抑制黑色素瘤的转移；Zhang等［11］研 究 表 明miR-425通 过 直 接 靶 向PDCD10在结直肠癌中调节肿瘤进展。本研究分析了膀胱癌组织中miR-425的表达水平与患者临床特征的相关性，结果提示高表达水平的miR-425与肿瘤的高组织学分级、肿瘤直径密切相关，而与患者的性别、年龄等无明显相关性。进一步的研究中发现miR-425在膀胱癌组织的表达显著增加，且沉默miR-425表达促进了膀胱癌细胞的凋亡，抑制了细胞的迁移和侵袭，提示miR-425可能与膀胱癌的发生及发展有关，在膀胱癌中发挥促癌的作用。

为进一步探讨miR-425在膀胱肿瘤中的发生机制，本研究利用miRNA靶基因网站microrna.org预测DKK 3为miR-425的下游靶点，荧光素酶报告实验进一步验证了DKK3是miR-425的下游靶基因。重组人Dickkopf相关蛋白3（DKK 3）是人类Dickkopf家族的主要成员，通过编码分泌蛋白来决定胚胎发育过程中细胞的命运［12］。DKK3在多种癌症中异常表达，通过多种途径改变细胞迁移和侵袭能力。据报道，DKK3通过调节胰腺癌Bxpc-3细胞中β-catenin/EMT信号通路抑制肿瘤进展［13］。此外，敲除DKK3基因可抑制口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭，并参与Wnt信号通路的激活［14］。本研究通过体外膀胱癌T 24细胞实验探讨了miR-425和DKK3的关系，结果显示：沉默miR-425表达后，DKK 3水平表达明显增加，提示miR-425可能通过靶向DKK3对膀胱癌生物学行为进行调控。

综上所述，miR-425通过靶向DKK3影响膀胱癌细胞的凋亡、迁移及侵袭的能力，从而影响膀胱癌的发生发展，这将为膀胱癌生物靶向治疗提供可能的靶点，也为miR-425的临床应用提供了理论支持。