hsa-miRNA-216a-5p在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中负性调控NPR3表达

徐 昊 许闫严 马中希 刘贤莉 尹秀萍

武汉市第四医院/华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科 湖北 武汉 430033

骨质疏松症表现为骨量减少、骨骼微细结构发生破坏，导致骨骼脆弱而易发生骨折，严重威胁中老年人的身体健康。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，MSC）作为成骨细胞和脂肪细胞共同的前体细胞，其平衡分化过程直接决定骨骼质量［1］。体外培养的MSC在成骨诱导剂（地塞米松、β-甘油磷酸钠联合维生素C）作用下，经14～21 d可分化为具有一定功能的成骨细胞，利用这一体外诱导模型，可以较为方便地研究成骨分化的 部 分机 制［2］。微 小RNA（microRNA，miRNA，miR）是发生在转录后水平的重要生物调节因子，对机体生理/病理活动包括成骨分化过程产生复杂的调控作用［3］。前期工作中，我们通过高通量测序发现hsa-miRNA-216a-5p（miR-216a）在MSC向成骨细胞分化过程中表达下降。本研究通过体外实验，验证miR-216a在成骨分化过程中的表达，观察其对成骨分化的影响，并证实其对侯选靶基因利尿钠肽受体3（NPR3）的调控作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂人源性原代培养骨髓间充质干细胞（hMSC）受赠于江西省系统生物医学重点实验室。培养环境：37℃，5%CO2，每隔48 h传代1次。选择第6代hMSC进行成骨诱导，诱导剂成分为：DMEM培养液中含10%胎牛血清、100 mmol/L地塞米松、10 mmol/L甘油磷酸钠和50 ng/mL维生素C。

1.2 慢病毒感染介导外源性miR-216a-5p表达的慢病毒颗粒及其阴性对照由上海吉凯基因公司提供。感染前12～18 h，hMSC接种于6孔板，细胞密度为50%左右加入慢病毒颗粒感染12 h后换液正常培养；72 h后在倒置荧光显微镜下观察细胞状态。

1.3 Real-time PCRRNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒均购自天根生物技术有限公司。收集各组细胞，经反转录后，使用特异性引物进行扩增，引物序列见表1。反应条件：94℃4 min→94℃30 s→56℃30 s→72℃30 s，循环40次。用2-△△Ct法计算靶基因相对表达量并根据分析结果绘制柱状图。

表1 Real-time PCR扩增引物序列

1.4 茜素红染色鉴定细胞成骨诱导14 d后，4%多聚甲醛固定，加入2%茜素红染液染色30 min，倒置显微镜下观察。

1.5 Wester n Blot检测收集细胞，经PBS洗涤后，使用RIPA强裂解液提取细胞内总蛋白，并测定细胞内总蛋白浓度，每个样品取10μg细胞内总蛋白，电泳，转膜，5%BSA封闭，1∶1 000稀释一抗（NPR3、GAPDH），1∶5 000稀释二抗，TBST洗膜，ECL发光体系凝胶成像系统采集实验结果。目的条带的灰度值除以GAPDH（内参）条带灰度值，即为条带经过校正后的灰度值。

1.6 双荧光素酶检测包含NPR3-3'UTR的野生型荧光素酶报告质粒和相应的突变型质粒由上海吉凯基因公司提供。HEK293细胞按50 000个/孔接种于24孔板，每组设3个复孔，置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，细胞融合70%～80%时转染。将野生型NPR3-3'UTR（WT）或突变型NPR3-3'UTR（Mut）与miR-216a或阴性对照（NC）联合转染HEK 293细胞，6 h后换液正常培养。转染72 h后收集细胞，双荧光素酶报告系统（Promega）检测荧光素酶活性。

1.7 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行数据分析，结果以±s表示，采用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-216a在成骨分化过程中表达下降使用成骨诱导剂刺激hMSC成骨分化21 d，茜素红染色显示细胞外基质矿化（图1A）；同时，各种成骨相关基因如ALP、RUNX2和Osterix在第7天和第14天出现升高，表明成骨诱导成功（图1B～1D）。在此基础上，Real-time PCR显示miR-216a的表达在成骨分化的第7和14天显著下降（图1E）。

图1 miR-216a在h MSC成骨分化过程中表达下调

2.2 高表达miR-216a弱化hMSC的成骨分化能力通过慢病毒介导外源性在hMSC中高表达，并以成骨诱导剂进行刺激，发现上调miR-216a削弱成骨分化能力，表现在：①在分化第21天，高表达miR-216a的细胞矿化程度降低（图2A）；②在分化的第7、14天，高表达miR-216a的细胞中ALP、RUNX2和Osterix表达受到抑制（图2B～2D）。

图2 高表达miR-216a抑制h MSC的成骨分化能力

2.3 miR-216a调控NPR3表达作为miR-216a潜在靶基因，NPR3的转录水平在成骨分化第7、14天升高（图3A），趋势与miR-216a相反。将miR-216a上调的hMSC进行成骨诱导，在分化的第7、14天，NPR3的mRNA表达与对照组相比受到抑制；同时NPR3在蛋白水平也有30%左右的下降（图3B～3D）。

图3 高表达miR-216a抑制NPR3表达

2.4 miR-216a作用于NPR3基因的3'UTRTargetscan网站预测显示，miR-216a与NPR3的3'UTR存在1处序列互补，位于3'UTR的第31～37位核苷酸；而与ALP、RUNX2和Osterix基因的3'UTR无互补性。为了评估miR-216a是否直接靶向NPR3，我们将包含NPR3-3'UTR的荧光素酶表达质粒（WT）及其突变体质粒（Mut）与miR-216a表达载体共转染。荧光素酶活性测定的结果显示，miR-216a可显著抑制WT报告基因活性，但不抑制Mut报告基因的表达（图4）。

图4 miR-216a直接作用于NPR3的m RNA

3 讨论

miRNA是调控成骨分化的重要因素之一，例如在成骨分化中RUNX2是miR-135的靶向调控基因［4］，miR-214则通过靶向Osterix抑制成骨分化［5］，而miR-216a尚未被报道参与成骨分化过程。该基因定位于人类染色体2p16.1，在其转录区上游有包括CAAT盒和CSX的结合位点的高度保守的序列［6］。Sun等［6］通过微阵列分析发现miR-216a在人类肾脏中高度表达，在心脏、脾脏、肺、肌肉和前列腺中几乎没有表达，但是我们的研究结果显示miR-216a在人间充质干细胞中有表达。值得注意的是，在成骨分化的第7天和14天，miR-216a表达下降约50%，这种表达趋势与上述调控成骨分化的miRNA具有相似性，提示miR-216a可能参与了成骨分化过程。进一步研究显示miR-216的高表达抑制了hMSC的成骨分化过程，表现为成骨分化特异性转录因子ALP、RUNX2和Osterix的下降，并得到茜素红染色结果的支持，这一发现扩大了我们对miR-216a功能的认识。

miRNA发挥作用通常是与靶基因的mRNA的3'UTR结合，诱导靶基因的翻译抑制或者mRNA降解［7］。将TargetScan预测miR-216a的靶基因与转录组测序结果进行合并分析，我们注意到NPR3基因。结果显示，NPR3在成骨分化过程中呈现高表达趋势，与miR-216a的表达呈现负相关，有可能受到miR-216a的调控。

NPR3基因定位于人类染色体5p13.3，编码产物为三种利钠肽受体之一［8］。利钠肽功能广泛，其与相应的受体组成的信号通路参与调节血容量和血压、肺动脉高压、心脏功能等生理活动［9］。而利钠肽过度产生导致骨骼过度生长和儿童骨骼异常，尤其影响身高、椎骨和手指长度［10］，表明其对于软骨内骨化和骨生长具有重要调节作用。利尿钠肽受体是具有细胞内鸟苷酸环化酶活性的单跨膜催化受体，有3种亚型，其中NPR3基因的编码产物被称为C型利尿钠肽受体，负责通过受体的内吞作用清除循环和细胞外利钠肽，调节利尿、血压和骨骼发育［11］。NPR3突变的小鼠利钠肽活性增高，表现出骨骼过度生长表型，导致细长的身体和驼背，与利钠肽过度表达产生的表型类似［12］。在hMSC向成骨分化过程中，NPR3与RUNX2、DLX5等成骨基因一同表达上调［13］，但对成骨分化的作用还不清楚，我们推测可能与基因表达的负反馈调控有关。

miRbase数据库显示，目前有26个miRNA被报道参与调控NPR3的表达，其中包括人源性4个miRNA，如hsa-miR-16-5p（MIRT 001435）、hsa-miR-30a-5p（MIRT 005159）、hsa-miR-335-5p（MIRT 017512）、hsa-miR-98-5p（MIRT 027551），其余为鼠源性。有趣的是，以上4个miRNA都被报道参与骨骼的病理活动［14-17］。我们的结果增加了NPR3基因的miRNA调控谱，也提示NPR3在成骨分化过程中的潜在作用。

综上所述，hsa-miRNA-216a-5p负性调控骨髓间充质干细胞成骨分化过程，NPR3是其中的潜在靶基因。后续研究将通过基因回补实验以及沉默NPR3表达来进一步验证其中的分子机制。