烟籽油碱催化异构化制备共轭亚油酸技术研究

张建会，李清钰，肖 勇，杜咏梅，杨兴友，江 鸿，侯小东*

(1.中国烟草总公司四川省公司，四川成都 610041；2.中国农业科学院烟草研究所，山东青岛 266101)

共轭亚油酸(CLA)是含有共轭双键的十八碳二烯酸在不同位置和立体构型上形成的异构体的总称。CLA 异构体种类繁多，现已发现有28 种，其中以c9，t11-CLA 和 t10，c12-CLA 的研究较多，生理活性突出。研究表明c9，t11-CLA 和 t10，c12-CLA 具有抗癌、抗炎、抗糖尿病、减肥、增强免疫力等功能，广泛应用于保健品、功能食品及食品添加剂等领域。天然的CLA主要存在于一些反刍动物如牛、 羊的乳脂及肉制品中，含量甚微，因此人工合成成为获取 CLA 的主要途径。人工合成CLA是将亚油酸或富含亚油酸的原料，通过异构化反应制得。而为了得到含量较高的CLA，通常需要植物油亚油酸含量达到50%以上，目前用于生产植物油主要有红花籽油、大豆油和葵花籽油等。其中，红花籽油亚油酸含量80.37%，是生产CLA的主要原料。但红花籽产量不高(1 800 kg/hm)，且药用红花与油用红花存在竞争，用于生产红花籽油的红花有限。

烟草种子含油量40%，油中不饱和脂肪酸含量达到89.38%，亚油酸(LA)含量最高(74.5%～76.9%)，LA含量和红花籽中相当。研究表明，烟草种子产量1 800 kg/hm与红花籽产量相似，而烟草种子可以在烟叶采摘结束后留花留种，因此烟草种子作为原料更有优势。笔者以烟籽油作为原料，以强碱为催化剂，通过碱异构化法制备 CLA，探索不同因素对CLA转化率的影响，然后通过响应面试验优化，形成烟籽油制备 CLA 的工艺条件，以期为草种子油作为原料制备CLA提供科学依据。

1 材料与方法

烟籽油：热榨自制。脂肪酸组成及含量：棕榈酸7.42%，硬脂酸2.56%，油酸10.06%，亚油酸79.15%，亚麻酸0.81%。

CLA 标准品，Sigma公司；丙三醇、乙二醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇、正己烷、无水乙醇、氢氧化钾、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；三氟化硼(分析纯)，上海麦克林生化科技有限公司。

7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)，cp-sil88毛细管柱(美国Agilent公司)，WH220-HT磁力搅拌机(德国WIGGENS公司)，电子分析天平(奥豪斯仪器上海有限公司)，RE100-PRO旋转蒸发仪(北京Dragonlab公司)，DHG-9240A电热鼓风干燥箱(杭州蓝天化验仪器厂)，KQ-500DA数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

烟籽油制备CLA方法。2.0 g氢氧化钾溶于20 mL丙二醇中，N保护油浴加热到170 ℃，加入5 g烟籽油，反应4 h，冷却至室温，加入蒸馏水终止反应。样品转移到分液漏斗，加入HCl调节pH为1～3。用正己烷萃取并用饱和NaCl溶液洗涤至中性。萃取液蒸去正己烷，得到含有CLA的混合脂肪酸。

游离脂肪酸甲酯化方法。将含有CLA的混合脂肪酸0.3 g加入5 mL BF-CHOH溶液中，迅速置于80 ℃油浴锅中反应10 min，反应结束后，冷却至室温，得到透明溶液。溶液中加入一定量的饱和NaCl溶液，轻轻振荡，正己烷萃取2次合并，无水硫酸钠过膜干燥装瓶，采用GC-MS分析检测脂肪酸的组成及相对含量。

脂肪酸甲酯检测方法。分析柱：CP-Sil88(100 m×250.0 μm×0.2 μm)，载气：氦，流速：24 mL/min，分流比：20∶1，进样量：1 μL，柱升温程序：120 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速率升温到200 ℃，保持28 min。

所有数据运用Excel、SPSS和Designer Expert软件进行处理和分析。

2 结果与分析

在丙二醇20 mL，氢氧化钾2.0 g，烟籽油5 g，反应时间4 h的条件下，研究反应温度130、140、150、160、170、180 ℃对CLA转化率的影响，结果见图1。从图1可见，在反应温度为130 ℃时，亚油酸异构化为CLA的转化率为4.50%，随着温度的升高，转化率也逐渐升高，在反应温度达到180 ℃时，转化率可达到89.92%。综合考虑异构化反应转化率和溶剂的沸点(丙二醇在180 ℃临近沸点)，选择160～180 ℃作为下一步优化反应条件的温度。

图1 反应温度对CLA转化率的影响Fig.1 Effect of reaction temperature on the conversion rate of CLA

在丙二醇20 mL，氢氧化钾2.0 g，烟籽油5 g，反应温度170 ℃的条件下，研究反应时间1、2、3、4、5、6 h对CLA转化率的影响，结果见图2。从图2可见，在反应时间为1 h时，亚油酸异构化为CLA的转化率为5.77%，随着反应时间的延长，转化率先逐渐增高，在5 h时转化率最大，达64.54%；反应时间延长为6 h，转化率反而降低(49.91%)。反应时间选择4～6 h作为下一步优化反应条件。

图2 反应时间对CLA转化率的影响Fig.2 Effect of reaction time on the conversion rate of CLA

在丙二醇20 mL，烟籽油5 g，反应时间4 h，反应温度170 ℃的条件下，研究催化剂用量0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 g对CLA转化率的影响，结果见图3。从图3可见，当催化剂用量小于1.0 g时，亚油酸异构化为CLA的转化率为2.10%，随着催化剂用量的增加，异构化率急剧增加，当用量达到3.0 g以后，趋势明显变缓，转化率达到94.00%以上。综合考虑催化剂用量对异构化反应转化率的影响，选择2.0～4.0 g氢氧化钾作为下一步优化反应条件。

图3 催化剂用量对CLA转化率的影响Fig.3 Effect of catalyst dosage on the conversion rate of CLA

响应面试验因素及水平设计。在前期单因素试验的基础上，选取反应温度、反应时间、催化剂用量(油用量5 g)3个因素作为变量。以温度170 ℃、反应时间5 h、催化剂3.0 g为中心点，利用软件Design-Expert进行试验数据分析。响应面的试验因素及水平设计见表1，试验结果见表2。

表1 响应面试验因素及水平

表2 响应面试验结果

响应面及等高线分析。从图4可知，反应温度()和反应时间()交互作用显著。当温度为160～170 ℃，随着反应时间延长，反应温度升高，CLA转化率明显增大。从曲线的走势来看，催化剂用量在3.0～4.0 g，反应时间在4～6 h时，CLA转化率较高，催化剂用量和反应时间对转化率没有明显影响；在催化剂用量为2.0～3.0 g，随着催化剂用量的增加，反应时间的延长，CLA转化率显著增加，且反应温度(A)和催化剂用量(C)交互作用不显著。通过对模型进行分析，得到烟籽油最佳的制备条件是反应温度为171.18 ℃，反应时间为5.22 h，催化剂用量3.43 g，在该条件下CLA转化率预测值为93.32%。在该条件下进行3次试验，得到的结果平均转化率为(92.78±0.74)%，与预测值接近。

3 结论与讨论

碱催化异构法制备CLA是把含亚油酸的原料溶解于有机溶剂中，在惰性气体(常用氮气)保护、加热及催化剂(强碱)存在下使亚油酸发生共轭化反应，产生CLA。反应的转化率取决于原料、溶剂、催化剂(强碱)、反应温度和反应时间等因素。方法简单，易于操作，是目前最常用的制备CLA的方法之一。该研究是以氢氧化钾为催化剂，丙二醇作为溶剂，碱催化异构化法制备烟籽油CLA。该研究发现，反应温度在130～180 ℃，CLA转化率随着反应温度升高而呈增大趋势，这与陈丽敏等在研究核桃亚油酸制备CLA的结果相似。大量研究证明，碱异构化反应需要达到一定温度才有较高的转化率，但如果温度过高，油中的亚油酸易发生反应生成副产物，从而影响CLA的转化率。通过比较发现，不同植物油最佳反应温度相差很大。反应时间也是该研究中的重要条件，该研究发现反应时间4～5 h时，CLA转化率最高，超过5 h转化率反而降低。一般认为，异构化反应体系达到动态平衡后，随着时间延长，体系内易发生聚合反应和分子内环化反应而产生副产物，CLA转化率降低。催化剂用量是该研究中最重要的反应条件之一，该研究选用了氢氧化钾作为反应催化剂，研究发现在丙二醇20 mL，烟籽油5 g 时，氢氧化钾用量3.0 g时，CLA转化率最高，继续增加碱的用量达到4.0 g时，转化率基本不变。这是由于烟籽油中亚油酸在氢氧化钾作用下碳原子失氢，生成碳负离子，带有碳负离子分子相互碰撞，从而异构化生成CLA，随着氢氧化钾用量的增加，生成的碳负离子基本不变，反应达到平衡。该研究涉及的3个反应条件对CLA转化率均有显著影响，为了取得最优条件组合和转化率的最优值，需要选择合理的试验方法。

表3 碱催化烟籽油异构化CLA回归方程方差分析

图4 催化烟籽油异构化响应面及等高线分析Fig.4 Response surface and contour analysis of catalytic isomerization of tobacco seed oil

响应面法是一种试验拟合方法，通过对具有代表性的局部各点进行试验，回归拟合全局范围内因素与结果间的函数关系，取得各因素最优水平值，目前已广泛应用于CLA制备工艺中。张红玉等用红花籽油(亚油酸含量为77%)为原料，通过响应面法优化反应，CLA转化率为96.54%。潘群文等用海篷子籽油为原料(亚油酸73.52%)制备CLA，并对其组分进行了分析，通过响应面法优化反应，CLA转化率可达到94.60%，产物中CLA含量达到68.00%。郑云武等以橡胶籽油为原料(亚油酸含量38.04%)，CLA转化率为83.04%，CLA的含量为31.59%。笔者选择了反应时间、反应温度和催化剂用量3个条件进行优化，结果显示在丙二醇20 mL的反应体系下，反应温度为171.18 ℃，反应时间为5.22 h，催化剂用量3.43 g，CLA转化率最高，预测转化率为93.32%。在该条件下进行3次试验，平均转化率为(92.78±0.74)%。该研究结果表明，烟籽油亚油酸含量高，反应后CLA转化率高，与其他植物油相比有成分和原料优势，可以作为制备CLA的原料。

目前关于烟籽油开发利用的研究很少，不同品种资源种子产量还不明确，下一步将继续开展相关研究，筛选出种子产量、出油率、亚油酸含量高的品种，为烟籽油制备CLA提供更好的原料。此外，强碱类催化剂易对环境造成污染，需要开发出新的催化剂，近年也出现了一些非强碱类催化剂，但催化效率较强碱低得多，因此制备出对环境友好的高效率催化剂是异构化法制备CLA的下一步研究内容。