基于P53/AMPK通路车前子醇提物对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞自噬的作用研究

李 莹 陈建玲 吴佩蔚 黄亚哲 张 帅 刘 晴

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄女性常见的内分泌失调疾病，临床表现呈高度异质性，常见有肥胖症、高雄激素症、无排卵、多毛和精神问题等。我国流行病学调查数据显示，育龄期女性中PCOS发生率为8%～13%[1]。研究表明，卵泡发育障碍是PCOS的主要原因[2]。卵巢颗粒细胞是卵泡发育重要的支持细胞，正常情况下卵巢细胞增殖和自噬、凋亡处于平衡状态[3]。而卵巢颗粒细胞自噬异常激活可能会导致卵泡发育停滞，从而导致PCOS的发生[4]。有研究表明，通过抑制PCOS卵泡颗粒细胞过度自噬，可改善卵巢功能[5]。抑癌基因P53/AMP活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]信号转导通路对细胞自噬起到双向的调节作用可参与调控卵巢颗粒细胞自噬，可作为PCOS治疗药物的新靶点，为PCOS、不孕症等妇科疑难病症临床诊疗提供新思路[6]。车前子为常用中药材，常和其他药物配伍用于治疗PCOS[7]。本实验通过建立PCOS大鼠模型，探究车前子醇提物对PCOS改善作用及可能作用机制，旨在为临床治疗提供实验参考。

材料与方法

1.实验材料:(1)动物:雌性SPF级SD大鼠125只，8周龄，体质量200～220g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2018-0002。采用独立通风笼具分笼饲养，饲养环境温度为20～24℃，相对湿度为40%～60%，每天光照10h。(2)试剂与仪器:车前子醇提物95%，购自陕西凤栖梧生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium salt，CMC-Na)购自美国Sigma公司；来曲唑购自江苏恒瑞医药股份有限公司；自噬阻断剂3MA购自美国Sigma公司；磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)一抗、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase，p-AMPK)、抑癌基因p53和微管结合蛋白轻链3B(LC3B)一抗、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗均购自英国Abcam公司。低温高速离心机购自德国Sigma公司；流式细胞仪购自美国BD公司；全自动酶标仪购自中国BioBase公司；EPS300型蛋白电泳仪购自美国Thermo公司；石蜡包埋机购自德国Leica公司。

2.实验方法:(1)PCOS大鼠模型建立:大鼠适应性喂养7天，取24只作为对照组，用普通饲料饲养，并用超纯水配制成0.5%(质量分数)CMC-Na溶液，按照100g/ml灌胃，每天1次。取剩余101只大鼠构建PCOS模型：使用高脂饲料喂养，并将1mg/(kg·d)的来曲唑溶于0.5%(质量分数)CMC-Na溶液中配制成来曲唑混悬液，按照100g/ml灌胃，每天1次，连续21天[8]。于造模第10天起，取大鼠阴道分泌物，制备涂片，若无完整动情周期，则视为造模成功[9]。(2)分组及干预方法：建模成功的96只大鼠按体质量排序编号，利用计算机生成随机数分成4组，分别为模型组(n=24)、3MA组(n=24)、车前子醇提物低剂量组(n=24)和车前子醇提物高剂量组(n=24)。建模成功的第2天，开始灌胃给药。低剂量组按10mg/(kg·d)灌胃车前子醇提物，高剂量组按20mg/(kg·d)灌胃车前子醇提物，3MA组按10mg/(kg·d)灌胃自噬阻断剂3MA，对照组和模型组灌胃相应体积的0.9%氯化钠溶液，每天1次，连续14天[10]。(3)大鼠血清性激素水平检测：末次灌药后24h，腹主动脉采血4ml，4℃放置2h，离心半径40cm，3000r/min离心20min，取上清液[11]。用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)法，450nm波长处测定各孔的吸光度(A)值，根据标准曲线计算血清促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、睾酮(testosterone，T)及雌二醇(estradiol，E2)水平。(4)卵巢组织病理观察:每组取8只大鼠，用30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉大鼠，刨腹取出新鲜卵巢组织，10%中性甲醛浸泡固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，约4μm厚度，脱蜡、水化，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，中性树胶封片，光学显微镜观察大鼠卵巢组织病理形态变化。(5)卵巢颗粒细胞自噬率检测:每组取8只大鼠，将卵巢组织取出后用磷酸缓冲液(phosphate buffer，PBS)冲洗3次，每次5min。剔除脂肪组织，刺破卵泡，用吸管将卵母细胞吸出，收集颗粒细胞，PBS冲洗，200目筛过滤。离心半径10cm，800r/min离心5min。取下层沉淀物，PBS清洗3次，加入完全培养基重悬。调整细胞浓度至1×106个/毫升。用浓度0.05mmol/L单丹磺酰尸胺(dansylcadaverine，MDC)染色，37℃温育60min，之后用PBS清洗。用流式细胞仪检测卵巢颗粒细胞的自噬率[12]。(6)卵巢组织LC3B、p53、p-mTOR、p-AMPK蛋白的表达：每组取8只大鼠，采用蛋白质印迹(Western blot)法，取卵巢组织匀浆，并以PBS冲洗，于4℃下，离心半径60cm，12000r/min离心15min，弃去上清夜。研磨、离心、提取总蛋白，BCA试剂盒定量检测蛋白质。定量后每孔10μl上样电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温摇床封闭1h，一抗4℃过夜孵育，蛋白稀释浓度为LC3B(1∶1000)、p53(1∶1000)、mTOR(1∶2000)、p-mTOR(1∶1000)、AMPK(1∶2000)、p-AMPK(1∶2000)、GAPDH(1∶2000)，二抗室温摇床孵育2h，蛋白稀释浓度为二抗(1∶5000)。以ECL显色，暗室曝光、显影和定影，采用Quantity One软件测定蛋白条带的光密度值[13]。

结 果

1.各组大鼠血清性激素水平:大鼠血清性激素水平多组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组、3MA组、车前子醇提物低、高剂量组大鼠血清LH、T和FSH水平升高，E2水平降低(P<0.05)。与模型组比较，车前子醇提物低、高剂量组和3MA组血清LH、T和FSH水平降低，E2水平升高(P<0.05)。各组与模型组比较的指标变化中，3MA组指标变化高于车前子醇提物低剂量组，低于车前子醇提物高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 大鼠血清性激素水平比较

2.卵巢组织病理学变化观察:对照组细胞规整，排列整齐，可见不同发育时期的各种形态卵泡，大多均可见卵丘，颗粒细胞可达8～9层，可见多个黄体；模型组细胞极度不规整，囊状扩张卵泡和闭锁卵泡数目增多，颗粒细胞仅1～2层，仅有极少量黄体组织； 3MA组卵泡结构轻微混乱，颗粒细胞5～6层，有黄体组织；车前子醇提物低剂量组卵泡结构混乱，颗粒细胞3～4层，有少量黄体组织；车前子醇提物高剂量组卵泡少部分结构不清，颗粒细胞可达7～8层，有较多黄体组织，可见卵丘(图1)。

图1 卵巢组织病理学观察(HE，×200)A.对照组;B.模型组;C.3MA组;D.车前子醇提物低剂量组;E.车前子醇提物高剂量组

3.卵巢颗粒细胞自噬率对比较：卵巢颗粒细胞自噬率多组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组(7.11%±1.36%)比较，模型组(19.83%±2.85%)、3MA组(12.01%±1.32%)、车前子醇提物低(14.02%±1.83%)、高(9.23%±1.12%)剂量组自噬率显著升高(P<0.05)；与模型组比较，3MA组及车前子醇提物低、高剂量组自噬率有所下降(P<0.05)；3MA组自噬率低于车前子醇提物低剂量组，高于车前子醇提物高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。

4.颗粒细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、p53、p-AMPK、p-mTOR蛋白表达的影响:颗粒细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p53、p-AMPK、p-mTOR蛋白表达水平多组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK蛋白表达显著升高，p53、p-mTOR蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较，3MA组及车前子醇提物低、高剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK蛋白表达降低，p53、p-mTOR蛋白表达升高(P<0.05)。各组与模型组比较的蛋白表达水平变化量中，3MA组蛋白表达水平变化量高于车前子醇提物低剂量组，低于车前子醇提物高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05，表2、图2)。

表2 各组p-AMPK、p-mTOR、p53、LC3Ⅱ蛋白相对表达量

图2 车前子醇提物对颗粒细胞中LC3Ⅱ、p53、p-mTOR、p-AMPK蛋白表达的影响1～5分别为对照组、模型组、3MA组、车前子醇提物低剂量组、车前子醇提物高剂量组

讨 论

PCOS病因不明，发病机制复杂。中医认为PCOS主要是脾、肝、肾三脏及冲任二脉功能失调所致，常选用穴位埋线、针灸，或健脾化痰、补肾疏肝、调理冲任治疗。西医认为，其主要与高雄激素血症、慢性炎症及胰岛素抵抗密切相关，常采用避孕药、胰岛素增敏剂，或生活干预、手术治疗[14]。车前子在治疗PCOS时常配合其他药物一起服用，具有清热利尿、渗湿止渴、祛痰消炎、降血糖的功效[15,16]。探究其作用机制，有利于中西医结合在临床的应用。

本研究通过血清性激素含量测定、卵巢组织病理学变化观察、卵巢颗粒细胞自噬率变化可以看出，与对照组比较，模型组大鼠血清性激素水平失调，卵巢组织发生双侧卵巢明显增大、出现大小不一的卵泡等病变，卵巢颗粒细胞自噬率升高等现象；经过车前子醇提物及3MA作用后，血清LH、T和FSH有所降低，E2有所回升，卵巢组织病变程度减轻，颗粒细胞自噬降低，说明车前子醇提物可调节性激素水平，减轻卵巢病变，减少颗粒细胞自噬，可以一定程度上缓解PCOS病症，且PCOS大鼠的病情与车前子醇提物的剂量也有一定关系，与车前子醇提物低剂量组比较，车前子高剂量组大鼠病情越轻。邢玉等[17]研究含有车前子的归术益坤方可通过调控相关信号通路中关键基因表达，来抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞自噬。黄玉华等[18]使用车前子作为重要药材治疗PCOS，以往的研究也证实了车前子对PCOS的有效性。

自噬是一种精确调节的细胞程序，多条通路在自噬过程中发挥重要作用。p53/AMPK信号通路是调控自噬的重要通路，p53是一种抑癌基因，与细胞自噬性死亡相关，AMPK是真核细胞能量调节器，与细胞能量生成、凋亡和自噬等过程有关，mTOR是调节细胞增殖、运动、存活和自噬等上游通路的汇合点，在自噬过程中发挥关键作用。自噬通常是AMPK激活和mTOR失活的结果，在AMPK/mTOR通路中，AMPK在细胞内被激活后，可磷酸化活化下游mTOR，进而触发自噬[19]。当细胞内p53累积时，AMPK/mTOR通路信号减弱，抑制细胞自噬[20]。LC3是自噬相关蛋白，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化是发生自噬的表现[21]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组p53和p-mTOR蛋白表达水平下降，p-AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达上升，通过车前子醇提物及自噬阻断剂3MA的作用，p53和p-mTOR蛋白表达水平上升，p-AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平下降，且高剂量组的作用效果优于低剂量组，与3MA效果一致，说明车前子醇提物起到了调节p53/AMPK信息通路自噬因子的作用，调控效果与以往研究相符[22]。综上所述，车前子醇提物可能通过调控p53/AMPK信号通路来抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞的自噬，这可能是车前子醇提物治疗PCOS的新机制。

本实验从宏观、微观上研究车前子醇提物对PCOS大鼠的影响作用。宏观上车前子醇提物可改善卵巢中性激素水平，减轻病变，降低自噬率。微观上，通过对p53/AMPK信号通路相关蛋白表达检测也发现了改变，说明车前子醇提物减少PCOS颗粒细胞自噬，可能与调控p53/AMPK信号通路有关。另外，本研究每只动物建模和末次灌胃存在时间差，检测数据可能存在偏倚，进一步的研究中应尽量使动物的干预时间保持一致，确保实验结果的准确性。此外，车前子醇提物是否存在其他调控通路，尚需进一步研究。