益髓方对环磷酰胺致血小板计数减少模型小鼠的影响

姚 靓 宋延平 陈信义 田劭丹

血小板减少症在临床中较为常见，血小板计数轻度减少时患者常无明显临床症状，血小板计数中度减少时可见出血现象，如皮肤紫癜、牙龈出血，口腔黏膜出血等。血小板计数重度减少时则可能出现脏器出血，特别是致命的颅内出血[1]。导致血小板计数减少最常见的是血液系统疾病，其次是风湿免疫病、恶性肿瘤放化疗及其他药物相关性血小板减少症等[2～7]。具有益气养阴活血功效的益髓方为北京中医药大学东直门医院院内制剂，已在临床应用近30年，对骨髓增生异常综合征低危患者外周血象具有明显改善效果[8～10]。同时，通过长期临床应用观察，益髓方对血小板计数减少亦有较好提升效果[11]。笔者所在课题组在承担国家“十一五重大新药创制科技专项”研究过程中，选取环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)致血小板计数减少小鼠模型为研究对象，采用不同剂量益髓方进行干预，观察模型小鼠外周血血小板计数变化，以期为将益髓方拓展应用于治疗血小板减少症提供客观依据。

材料与方法

1.动物：KM小鼠由西安交通大学医学院实验动物中心提供[合格证号：0001303，许可证号：SCXK(陕)2007-001]，室温20～24℃，相对湿度为40%～70%，光照8h/d，排风扇通风2次/天，每次1h，雌雄分笼饲养，自来水自由摄取，饲料为实验动物全价营养饲料，适应性观察1周后进行实验。

2.药物与试剂：益髓方由陕西星华研究所按照中药新药研究工艺制备并提供。按照医院制剂成人每日45g成药处方量，体重按60kg计，服药量为0.75g/kg体重。阳性药物益血生胶囊，生产批号：110915，批准文号：国药准字Z19983056，成人每粒0.25g。口服，每次4粒，每日3次。体重按60kg计，服药量为0.05g/kg体重。浙江天杭生物科技有限公司生产的出生2h内的健康新生牛无支原体血清，质量级别：超级，装量：200ml，最终过滤孔径：0.1μm(生产批号：100701)；瑞氏色素(批号：20100422)购自天津傲然精细化工研究所；甲醇(批号：110416)购自天津市富宇精细化工有限公司。

3.仪器：电子天平(型号：BS210S)，精确度0.1mg，购自北京赛多利斯天平厂；XSZ-H型彩色摄像机由北京杰伟世视音频设备有限公司组装。Exigo Vet 动物血细胞分析仪从瑞典EXIGO公司进口。

4.造模：参照参考文献[12]方法，先取16只健康KM小鼠，雌雄各半，随机分为两组，模型组和正常对照组。模型组按体质量腹腔注射环磷酰胺注射液首剂量200mg/kg，0.1ml/10g，1次/天。次日起给予维持剂量30mg/kg，0.1ml/10g，1次/天，连续6天。正常对照组按体质量腹腔注射0.9%氯化钠溶液，0.1ml/10g，1次/天，连续7天。末次给药24h后，摘眼球取血，检测模型小鼠外周血血小板计数，进行t检验，当发现模型组外周血血小板计数明显低于正常对照组时(P<0.05)，表明预实验成功，再按照此造模方法进行正式试验。

5.分组：取健康KM小鼠72只，雌雄各半，体质量18～22g，随机分为正常对照组、模型对照组、益血生胶囊对照组与益髓方大、中、小剂量组。

6.给药：除正常对照组之外，其余各组小鼠按体质量腹腔注射环磷酰胺注射液首剂200mg/kg，0.1ml/10g，1次/天。次日起给予维持剂量30mg/kg，0.1ml/10g，1次/天，连续6天；正常对照组按体质量腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.1ml/10g，1次/天，连续7天。益髓方按临床每公斤体质量服药量0.75g/kg，小鼠给药大、中、小剂量分别为15g/kg、7.5g/kg、3.75g/kg，分别为临床拟用剂量的20、10、5倍；益血生剂量1g/kg为临床拟用剂量的20倍。于造模当天起，灌胃给药，1次/天，连续7天。

7.检测指标：末次给药后24h，各组小鼠分别摘眼球采血，用动物血球计数仪检测各组小鼠外周血小板(platelet，PLT)、白细胞(white blood cell，WBC)计数，并进行统计学处理。实验结束后处死小鼠，取股骨，除净软组织，用6号针头以1ml小牛血清冲出骨髓细胞，200目筛网过滤制成单个骨髓细胞悬液。将单个骨髓细胞悬液以1000r/min离心5min，去上清，洗涤2次，弃上清，小牛血清定容至5ml。制备骨髓涂片，瑞氏染液染色。由陕西省中医学院药物研究所血液实验室专科实验师按白细胞计数法进行骨髓有核细胞计数，并进行评分。骨髓增生程度判定标准：①骨髓增生极度活跃：有核细胞占全部细胞(包括无核红细胞)的比例≥50%或有核细胞≥100个，评4分；②骨髓增生明显活跃：有核细胞占全部细胞(包括无核红细胞)的比例>10%且<50%或有核细胞>50个且<100个，评3分;③骨髓增生活跃：有核细胞占全部细胞(包括无核红细胞)的比例≤10%且>1%或有核细胞>10个且≤50个，评2分;④骨髓增生减低：有核细胞占全部细胞(包括无核红细胞)的比例≤1%或有核细胞≤10个，评1分;⑤骨髓增生极度减低：有核细胞占全部细胞(包括无核红细胞)的比例≤0.5%或有核细胞≤5个，评0分。

结 果

1.对血小板计数的影响：实验各组小鼠外周血血小板计数检测结果详见表1。与正常对照组比较，模型对照组小鼠外周血血小板计数明显减少(P<0.01)。与模型对照组比较，益髓方大、中、小剂量组小鼠外周血血小板计数明显提升(P<0.05，P<0.01)。表明益髓方各剂量均有治疗CTX致血小板减少作用。

表1 实验各组小鼠外周血血小板计数检测结果

2.对白细胞计数的影响：实验各组小鼠外周血白细胞计数检测结果详见表2。与正常对照组比较，模型对照组、益血生胶囊对照组、益髓方各剂量组小鼠外周血白细胞计数均明显减少(P<0.01)。与模型对照组比较，益血生胶囊对照组小鼠外周血白细胞计数明显高于模型对照组(P<0.05)；益髓方各剂量组小鼠外周血白细胞计数与模型对照组比较,差异无统计学意义。表明对照药益血生胶囊有治疗CTX致白细胞减少作用。

表2 实验各组小鼠外周血白细胞计数检测结果

3.对骨髓增殖的影响：按照骨髓增殖程度分级标准，实验各组小鼠骨髓增殖程度检测结果详见表3。与正常对照组比较，模型对照组小鼠骨髓增殖程度评分明显升高(P<0.05)，可能与应用CTX后骨髓反应性增生有关。与正常对照组比较，用药各组小鼠骨髓增殖程度差异无统计学意义(P>0.05)，表明应用益血生胶囊、益髓方各剂量干预后CTX模型小鼠没有发生显著骨髓抑制。

表3 实验各组小鼠骨髓增殖程度检测结果

讨 论

CTX属广谱抗肿瘤药物，常与其他抗肿瘤药物组成联合化疗方案，对各种类型的白血病和实体瘤均有治疗效果[13]。CTX作为免疫抑制剂，还可用于治疗各种自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾病综合征、多发性肉芽肿、天疱疮以及溃疡性结肠炎、原发免疫性血小板减少症等，也是自体造血干细胞移植的干细胞动员剂[14～17]。CTX在临床应用中可见不同类型及不同程度的不良反应，其中对骨髓造血的影响使其成为制备骨髓抑制动物模型的常用药物[18，19]。

益髓方(原名益髓颗粒剂)由炙黄芪、党参、生地、熟地、菟丝子、丹参、龟板胶、阿胶、桃仁、红花、地龙、白花蛇舌草、鸡血藤、蜈蚣等组成。炙黄芪为治诸气虚之要药；阿胶擅补血、止血、滋阴润燥；两药合用可达益气养阴、补血生血之功效，在方中为君药。熟地可滋阴补血、益精填髓；丹参能活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神；鸡血藤能补血、活血、通络；三药合用既能补益肝肾、填精生髓，又能活血通络、祛瘀生新，辅助君药加强益气养阴，生血补血之效，在方中为臣药。党参能补中益气、生津养血；红花可活血化瘀；生地能清热凉血、养阴生津；龟甲胶可滋阴潜阳、补肾填精；诸药合用，即可强健脾胃，促进水谷精微吸收，化营为血，又可补益肝肾，滋阴养血，在方中为佐药。菟丝子功效补阳益阴，在诸多滋阴药中加入补阳药，取阳中求阴之意；又因肝肾同源，基于“肾主骨生髓”理论，取菟丝子能引诸药走五脏、入骨髓、调和气血阴阳之性，在方中为使药。综观全方诸药合用达“益气养阴(血)、活血通络、祛瘀生新”之功效[20]。

益髓方原意用于骨髓增生异常综合征低危患者治疗，能够缓解或稳定患者外周血象，延缓急性白血病转化速度，降低转白率，并能够降低患者感染概率[21,22]。在临床应用中，通过观察发现，益髓方对免疫性血小板减少症也具有较好疗效，有促进骨髓病态巨核细胞分化成熟等效果[23]。因此，课题组通过本次研究拟探索益髓方对化疗所致血小板减少症的疗效。结果显示，与模型对照组比较，益髓方大、中、小剂量组小鼠外周血血小板计数均明显提升(P<0.05)，表明益髓方各剂量组均对CTX致血小板计数减少有治疗作用。与模型对照组比较，益血生胶囊对照组小鼠外周血白细胞计数明显升高(P<0.05)，而益髓方高、中、低剂量组比较差异无统计学意义，表明益髓方对CTX致白细胞计数减少治疗效果不明显。与正常对照组比较，模型对照组小鼠骨髓增殖程度评分明显升高(P<0.05)，可能与应用CTX后骨髓应激反应有关，其结果与CTX联合粒细胞集落刺激因子能够动员骨髓造血干细胞一致，相关机制尚需要进一步研究。与正常对照组比较，用药各组小鼠骨髓增殖程度差异无统计学意义(P>0.05)，表明应用益血生胶囊、益髓方各剂量干预后CTX模型小鼠未发生显著骨髓抑制。

综上所述，益髓方大、中、小剂量组对CTX致血小板计数减少模型小鼠有治疗作用，且可能有降低化疗致骨髓损伤作用，为益髓方治疗化疗相关血小板减少症提供了实验依据。阳性对照药益血生胶囊对CTX致模型小鼠白细胞计数减少有治疗作用，值得临床推广应用。由于红细胞寿命较长，在本实验中没有观察到红细胞与血红蛋白减少情况，故未在文中列出。