他克莫司对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

郑小菲，袁 泉，朱娟芳，秦帅华，赵红宇

1)郑州大学第一附属医院口腔医学中心 郑州 450052 2)四川大学华西口腔医院种植科 成都 610041

随着医学进步，近几十年来器官移植得到蓬勃发展，已成为治疗肝肾等器官终末期疾病的最有效手段[1]。随着器官移植患者寿命的延长，越来越多的免疫抑制剂使用者可能会面临牙齿缺失而需要修复的问题。种植修复是解决缺牙问题的最佳治疗方案。然而，有关免疫抑制剂使用人群能否进行牙种植治疗一直存在争议。他克莫司是从链霉菌属中分离的一种新型强力免疫抑制剂，其免疫抑制效应是传统免疫抑制剂环孢素A的10～100倍[2],其引起高血压和高脂血症的副作用相对更小，肝毒性更低[3]，对肾功能无影响[4]。鉴于以上优势，他克莫司已逐渐取代环孢素A成为肝脏、肾脏等器官移植患者的首选免疫抑制剂[5]。临床研究和动物研究[6-8]显示，他克莫司作用后骨量减少、骨矿化密度降低，导致骨质疏松。另有研究[9]表明，他克莫司抑制小鼠体内钛种植体的骨结合。但是他克莫司影响骨形成和骨吸收的具体机制尚不明确。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)具有多潜能干性，能分化为成骨细胞[10]。本研究观察了他克莫司对BMSC增殖和成骨分化的影响，以期为免疫抑制剂使用者进行牙种植治疗提供临床指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和实验动物他克莫司、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松、茜素红购自美国Sigma公司，α-MEM培养基、胰蛋白酶购自美国HyClone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒、总RNA提取试剂盒购自日本TaKaRa公司，碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。6～8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠购自成都市达硕实验动物有限公司。

1.2 小鼠BMSC的分离培养用12.5 g/L三溴乙醇过量麻醉处死小鼠，浸泡于体积分数75%乙醇中消毒3 min。剪开小鼠双侧后肢皮肤，完整取出股骨和胫骨，用含体积分数5%青链霉素双抗的PBS冲洗；将股骨和胫骨转移至无血清培养基中，剔除附着的肌肉和筋膜组织，PBS洗涤2次；剪开股骨和胫骨一端，插入1 mL冲洗针用培养基冲出骨髓，反复冲洗直至骨干发白，然后用5 mL含体积分数10%胎牛血清的培养基重悬细胞，转移至培养瓶中放置于体积分数5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。72 h后换液除去未贴壁细胞，之后根据细胞生长状况，每2～3 d更换新鲜培养基，于倒置显微镜下观察细胞形态，镜下可见培养至第7天时细胞完全伸展，呈长梭形,为BMSC。待细胞密度达到90%融合时，吸出培养基，PBS洗2次，加入少量0.5 g/L胰蛋白酶(含EDTA)进行消化，1∶2比例传代。

1.3 实验分组将他克莫司粉剂溶于二甲基亚砜，无菌滤器过滤，分装于EP管中，-20 ℃保存备用，使用时用培养基稀释至最终工作浓度(50、500 nmol/L)。

取第3代小鼠BMSC，接种于细胞培养板中，24 h后观察细胞贴壁情况，若细胞贴壁良好则更换为成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、青链霉素双抗、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C的α-MEM培养基)。低、高剂量他克莫司组成骨诱导培养基中分别添加终浓度为50、500 nmol/L的他克莫司，空白对照组不加他克莫司。每3 d更换成骨诱导培养基。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖将BMSC制备成5×104个/mL的单细胞悬液，取100 μL接种于96孔板，24 h细胞贴壁后弃去原培养基，按1.3分组更换为含0、50、500 nmol/L他克莫司的成骨诱导培养基培养。培养3 d进行CCK-8检测。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃条件下孵育2 h，于450 nm处测定光密度(optical density，OD)值。实验重复3次。

1.5 BMSC中成骨分化相关标志物mRNA的检测将BMSC以1×105个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后弃原培养基，按1.3分组更换为相应培养基培养5、10 d。收集细胞，采用qRT-PCR检测成骨分化相关标志物Runt相关转录因子2(Runx2)、锌指结构转录因子(Osterix)、Alp、骨钙蛋白(Ocn) mRNA的表达水平。引物序列见表1。提取总RNA，测定RNA浓度和纯度。反转录获得cDNA。PCR反应体系：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，Rox 参比染剂0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，用无核酸酶水补充至20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火31 s，共40个循环。以GAPDH为内参，根据公式2-ΔΔCt计算目的mRNA的相对表达量。实验重复3次。

表1 引物序列

1.6 BMSC成骨分化能力的测定BMSC按1.3分组处理10 d后，弃去培养基，PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min。PBS再次洗涤2次，每次2 min。按照ALP染色试剂盒说明进行ALP染色。采用定量试剂盒检测ALP活性：按试剂盒指示配制蛋白标准品及BCA工作液，使用酶标仪于562 nm处测定OD值，然后根据标准曲线和使用的样品体积计算样品中ALP的活性。实验重复3次。

细胞分组培养14 d后，吸去培养基，PBS清洗3次，每次5 min；体积分数95%乙醇固定20 min；蒸馏水清洗2次；加入10 g/L茜素红染液(pH 4.2)，37 ℃染色5 min；蒸馏水清洗2次。大体观察染色情况，并在倒置相差显微镜下观察钙化结节。收集钙化结节，用100 g/L氯化十六烷基吡啶孵育1 h，在562 nm波长处测OD值。实验重复3次。

1.7 统计学处理使用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较3组细胞增殖能力、成骨分化标志物mRNA的表达水平和成骨分化能力，两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组细胞增殖能力比较与空白对照组(0.60±0.09)比较，低、高剂量他克莫司组细胞增殖能力均升高[OD值分别为(1.25±0.10)、(1.32±0.12)，3组比较，F=14.406，P=0.005]，表明他克莫司可促进BMSC增殖。

2.2 3组细胞成骨分化标志物mRNA表达水平的比较见表2。培养5 d，与空白对照组比较，除Ocn外，低、高剂量他克莫司组细胞中各成骨分化标志物mRNA的表达水平均有不同程度的升高，除Alp外，无明显的剂量依赖性。培养10 d，低、高剂量他克莫司组Osterix和Ocn mRNA的表达水平升高。

表2 各组细胞Runx2、Osterix、Alp和Ocn mRNA表达水平的比较(n=3)

2.3 3组细胞成骨分化能力比较低、高剂量他克莫司组ALP染色较空白对照组加深(图1上排)。空白对照组和低、高剂量他克莫司组均可见钙化结节，低、高剂量他克莫司组钙化结节更多(图1下排)。定量结果见表3。与空白对照组比较，低、高剂量他克莫司组ALP活性增强，钙化结节增多，但2组间差异无统计学意义。

1～3：分别为空白对照组、低剂量他克莫司组、高剂量他克莫司组

表3 各组细胞ALP活性和钙化结节数的比较(n=3)

3 讨论

免疫抑制剂使用者会面临牙齿缺失修复的问题。在理想条件下，种植修复是替代缺失牙的最佳治疗方案。免疫抑制剂在发挥免疫抑制效应的同时可能影响骨改建和骨愈合。因此，免疫抑制剂使用者的牙种植问题引起了口腔种植医生的关注和重视，探索其具体作用机制具有重要意义。

骨代谢包括成骨细胞的骨生成和破骨细胞的骨吸收，二者维持骨生态的稳定。BMSC作为多潜能干细胞在合适条件下可以分化为成骨细胞；在体外培养时BMSC能够快速增殖，不丧失其干性特征，是组织工程等研究中的常用细胞[11]。因此本研究对小鼠BMSC进行成骨诱导，观察他克莫司对BMSC增殖和成骨分化的影响，旨在从细胞水平揭示他克莫司体内影响种植体骨结合原因。本研究结果发现，他克莫司作用下BMSC增殖能力强于空白对照组。Byun等[12]学者评价环孢素A和他克莫司两种免疫抑制剂对大鼠间充质干细胞的影响，结果发现，他克莫司可促进大鼠间充质干细胞的体外增殖，本研究结果与其相一致。

Runx2和Osterix是成骨分化过程中必需的转录因子，在成骨分化的早期进程中发挥重要的调控作用[13-14]。ALP是成骨分化过程中的早期标志物，其表达水平与成骨细胞分化成熟程度呈正相关[15]。OCN是成骨分化的中晚期标志物，主要由成熟的成骨细胞分泌合成，参与骨矿化过程，在骨矿化阶段其表达量增多[16]。本实验qRT-PCR结果显示，他克莫司作用5 d后，相比空白对照组，BMSC中Runx2、Osterix、Alp mRNA的表达水平上调；3组间Ocn基因表达水平差异无统计学意义，推测原因可能为分化早期Ocn分泌量较少。10 d后，3组Runx2和Alp mRNA表达水平差异无统计学意义；两他克莫司组Osterix mRNA表达水平仍高于空白对照组；3组Ocn mRNA的表达水平均有所上调，两他克莫司组的表达量高于空白对照组。培养14 d后茜素红染色结果显示，他克莫司组钙化结节增加，ALP活性增强。有研究[17]表明，他克莫司促进牙龈来源间充质干细胞的成骨分化，本研究结果与其一致。在成骨分化早、中、晚期，他克莫司均可促进BMSC成骨分化。

综上，本研究结果表明，他克莫司在体外可促进小鼠BMSC的增殖和成骨分化。先前研究表明他克莫司在体内抑制骨愈合，其原因可能由于他克莫司对破骨细胞的促进作用明显强于成骨作用或者由于其他间接因素的调控，具体机制有待进一步研究。