巴戟天寡糖对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌能量代谢障碍和细胞结构损伤的预防作用

王志红，程亮星，黄冬梅，邓克红，赵 虎，鲁笑钦，王武亮，胡 滨，刘 海，崔金全

1)郑州大学第二附属医院妇科 郑州 450014 2)郑州大学第一附属医院《肿瘤基础与临床》编辑部 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院心外科 郑州 450052

缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是大多数心血管疾病和心脏手术过程中常见的病理生理性损伤。巴戟天寡糖(morinda officinalis oligose，MOO)提取自中药巴戟天。课题组前期研究[1]证实，其对去卵巢大鼠心肌IRI有保护作用，保护机制主要与其抗氧化和抗凋亡作用有关。课题组前期研究[2]还证实，MOO能够通过改善子宫组织的能量代谢和抗氧化能力保护大鼠子宫组织免于IRI。围绝经期和绝经后激素水平异常可导致女性出现围绝经期综合征，心血管疾病等发生风险明显增加[3-4]。因此，无论是基础研究还是临床研究，针对围绝经期女性这一心血管疾病高发群体进行心肌IRI干预研究、寻找可行的保护措施，都具有重大意义。本研究观察了MOO对去卵巢大鼠心肌IRI后心肌组织高能磷酸化合物(high energy phosphate compounds,HEP)水平以及细胞结构的变化。

1 材料与方法

1.1 材料75只健康雌性SD大鼠，体重290～315(298±12) g，购自河南省实验动物中心[动物许可证号为SCXK(豫)2005-0001]。MOO提取由河南大学药学院完成，具体方法参考文献[5]。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)(美国Amresco公司)，日本岛津LC-6A型高效液相色谱仪、SPD-6A型紫外检测器(日本Shimadzu公司)，Scienhome C18色谱柱(250 nm×4.6 nm,5 μm)(江苏淮安市恒天公贸有限公司)，H-7500透射电镜(日本Hitachi公司)。

1.2 大鼠分组及给药方法75只大鼠经7 d适应性饲养后，按随机数字表法分为5组(每组15只)：对照组、假IRI组、IRI组、高剂量MOO组、低剂量MOO组。腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠(4 μL/g)麻醉后，取腹部正中切口，对照组仅游离卵巢，余4组均行双侧卵巢切除术，术后常规缝合和预防性抗感染处理。术后低、高剂量MOO组大鼠按体重分别给予含0.07、0.21 g/mL MOO药液10 mL/kg灌胃，其余3组给予双蒸水10 mL/kg灌胃，1次/d，连用7 d。

1.3 去卵巢大鼠心肌IRI模型制备假IRI组、IRI组、高剂量MOO组、低剂量MOO组大鼠末次灌胃1 h后，腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠麻醉，术前行气管插管，开胸，上动物呼吸机，并经左下肢股静脉按0.05 U/g推注肝素钠，充分暴露心脏。假IRI组大鼠仅游离心脏；余3组大鼠均用5号丝线于左冠状动脉前降支中上1/3处结扎血管，结扎成功标志为缺血区域变紫且心电图示ST段抬高，结扎30 min后解除结扎线再灌注60 min，取出心脏，其中10只置于-80 ℃冰箱待测HEP，5只放入预冷(0～4 ℃)体积分数4%戊二醛-磷酸缓冲液以备超微结构观察。

1.4 高效液相色谱法检测心肌组织中HEP水平取100 mg于-80 ℃冰箱保存的左心室组织，置入预冷0.42 mol/L高氯酸中，制成组织匀浆；加入1.00 mol/L氢氧化钾中和；超声波细胞粉碎器将线粒体膜粉碎，使得能量物质完全释放。将组织匀浆于4 ℃条件下15 000 r/min离心15 min。取上清液用0.2 μm微孔滤膜过滤。取20 μL滤液上柱分析，检测ATP、ADP和AMP水平。色谱条件：流动相为215 mmol/L磷酸二氢钾与体积分数3.5%乙腈组成，三乙胺调pH值至6.1，流速为0.5 mL/min，检测波长为210 nm，柱温30 ℃。按照公式计算心肌总腺嘌呤核苷酸(total adenine nucleotide，TAN)和心肌细胞能荷(energy charge，EC)：TAN=ATP+ADP+AMP；EC=(ATP+0.5×ADP)/TAN。

1.5 电镜下观察心肌超微结构变化取以预冷的戊二醛-磷酸缓冲液保存的大鼠心脏，从左心室游离壁处剪取1 mm×1 mm×3 mm的组织块，4 ℃固定8 h，经脱水、包埋、超薄切片、染色等步骤处理后，在电镜下观察心肌细胞超微结构。

1.6 统计学处理采用SPSS 23.0处理数据。用单因素方差分析比较5组大鼠心肌组织中ATP、ADP、AMP、TAN和EC水平的差异，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织中ATP、ADP、AMP、TAN和EC的比较与假IRI组和对照组比较，IRI组心肌组织中ATP、ADP、AMP、TAN和EC降低(P<0.05)。与IRI组比较，低、高剂量MOO组ATP、ADP、AMP、TAN和EC升高，高剂量MOO组以上指标高于低剂量MOO组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠心肌组织中ATP、ADP、AMP、TAN和EC比较(n=10)

2.2 各组大鼠心肌超微结构的变化比较对照组和假IRI组：心肌超微结构基本正常，心肌肌原纤维排列基本整齐，Z线清晰，部分肌节排列异常紧密，肌节间距出现少量不均匀现象，细胞核膜和线粒体膜基本完整，染色质均匀、细密，基质致密，嵴排列紧密且清晰，线粒体和糖原颗粒丰富，未发现间质水肿。IRI组：心肌细胞坏死明显，心肌肌原纤维排列紊乱、断裂或消失，Z线模糊或消失，线粒体大多或全部的嵴和膜融合或消失，糖原颗粒稀少或消失，间质明显水肿。高剂量MOO组：可见轻微的心肌细胞基质或线粒体肿胀、部分线粒体的嵴和膜融合等轻微损伤，较IRI组明显改善。低剂量MOO组：心肌细胞超微结构的损伤较IRI组有所改善，但较高剂量MOO组严重，心肌细胞坏死较为明显，肌节排列紊乱，Z线模糊，线粒体的少部分嵴和膜融合或消失，糖原颗粒较少，基质水肿。见图1。

1～5：分别为对照组、假IRI组、IRI组、高剂量MOO组与低剂量MOO组；A1～A5：放大倍数分别为5 000、4 000、6 000、4 000、5 000；B1～B5：放大倍数分别为20 000、10 000、20 000、20 000、20 000

3 讨论

雌激素与雌激素受体结合可以通过ATP敏感性钾离子通道相关信号转导通路等发挥保护心脑血管、改善子宫腺肌病症状等作用[6-7]。围绝经期女性由于雌激素水平迅速下降而失去了雌激素对心血管的保护作用，从而导致更高的心血管疾病发生风险[8-9]。谢慧慧等[10]研究发现，二仙汤改善围绝经期大鼠心脏电生理变化可能与其提高大鼠体内雌激素活性和增加其受体表达有关。研究[11-12]证实，一方面MOO具有类雌激素作用，可以缓解去卵巢大鼠的围绝经期症状；另一方面MOO具有抗氧化、抗凋亡作用，可以减轻围绝经期或衰老造成的机体慢性损伤。

本研究通过去卵巢的方式建立围绝经期大鼠模型；谢慧慧等[10]研究以及课题组前期研究[1]也已经证实了这一模型的可行性。另外，本课题选择的ATP、ADP、AMP、TAN、EC等指标可以直接反映心肌细胞能量代谢的变化，其水平高低随心肌IRI程度的高低而改变[4,13]；电镜下观察心肌细胞线粒体等超微结构的变化，可以直接评估心肌细胞的损伤程度，其中线粒体作为能量代谢的重要细胞器，其损伤程度与心肌细胞能量代谢的变化有着直接关系[14-15]。

IRI这一病理生理学过程中涉及能量代谢的变化。课题组前期研究[2]发现，MOO能够通过改善IRI大鼠子宫ATP、ADP、AMP和TAN的代谢水平，减轻子宫组织的损伤。研究[14-15]还发现，线粒体作为能量代谢的重要细胞器，其损伤是机体能量代谢障碍的病理学基础。董雪佳等[16]研究发现，瑞舒伐他汀通过减轻脑IRI过程中线粒体损伤，保护神经细胞免受损害。本研究发现，与假IRI组比较，IRI组心肌组织中ATP、ADP、AMP、TAN和EC降低，而高、低剂量MOO组以上指标较IRI组升高，且心肌细胞损伤较IRI组明显减轻，高剂量MOO组改善作用更显著。这提示IRI心肌出现了能量代谢障碍，其原因可能是心肌细胞超微结构，特别是线粒体结构的破坏影响了线粒体的正常功能，而MOO可能通过减轻线粒体损伤来改善其能量代谢，从而对IRI心肌起到保护作用。

总之，MOO预防性给药能够改善去卵巢大鼠IRI后心肌细胞能量代谢，从而减轻心肌IRI。