香茅醛对心肌缺血/再灌注损伤大鼠的抗氧化保护作用

华瑞，王琦，张愉，付国强，姚家久*（.空军军医大学唐都医院急诊科，西安 70038；.空军军医大学唐都医院内分泌科，西安 70038）

急性心肌梗死具有发病快，致死、致残率高等特点[1]，是急诊中常见的危重症，目前主要采用溶栓疗法及其他心外科技术降低患者的病死率，而心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）损伤是心肌梗死的治疗中十分常见的并发症，中断的血流突然恢复后会产生一系列不良反应（如心律失常、微循环障碍以及部分心肌细胞损伤进行性加重等[2-3]），仍然影响心脏功能，并给存活的患者带来其他伤害。因此寻找安全、有效、可行的方法减少MI/R 损伤的发生，对于提高急性心肌梗死患者的预后和生活质量具有重大的社会价值，也成为心血管领域的研究热点。大量数据表明，氧化应激是MI/R 损伤发生的重要机制之一[4-6]，具有抗氧化作用的药物对预防MI/R 损伤效果良好。香茅醛（citronellal，3，7-二甲基-6-辛烯醛）是从植物柠檬香茅中提炼出来的一种无环单萜醛[7]，能显著清除自由基，具有抗菌、抗惊厥、抗抑郁等作用[8]。香茅醛油可减少角叉菜胶诱导的中性粒细胞迁移并抑制髓过氧化物酶的释放[9]。香茅醛和香叶醇（另一种单萜醇）均可通过调节诱导性一氧化氮合酶来抑制 NO的产生，减少类固醇的释放[10]，阻滞炎症过程。香茅醛还可以降低高脂饮食诱发的氧化应激，够预防内皮功能障碍并抑制动脉粥样硬化的发生发展[11]。关于香茅醛在MI/R 损伤中的作用及其机制尚未见报道，考虑其具有挥发性香气，可应用于芳香疗法，并且属于天然物质、安全性高，因此有望成为心血管急重症治疗中预防并发症的新型手段，本研究旨在探索香茅醛对MI/R 损伤的保护作用及其机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

健康成年SD 雄性大鼠（SPF 级）50 只，体质量为200 ～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供。所有大鼠在温度、湿度适宜的环境中适应性喂养一周。实验前随机分为5 组，分别为假手术组，模型组，香茅醛低、中、高（50、100、150 mg·kg－1）剂量组，每组10 只。

1.2 试药

香茅醛（CAS106-23-0，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用时用乙醇溶解）。血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。核因子E2 相关因子2（Nrf2）、血红素氧化酶1（HO-1）（Abcam公司），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、辣根过氧化物酶标记的二抗（博奥森生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 动物模型制备与处理

将大鼠给予异氟烷吸入麻醉，呈仰卧位固定，连接心电监护仪并作气管插管，连接于小动物呼吸机（频率为5 次·min－1，潮气量为10 mL·kg－1，呼吸比为1∶2）。沿胸骨左缘打开胸腔，暴露心脏冠状动脉左前降支，在左心耳下方1 ～2 mm 处进针穿线，并将硅胶管沿丝线穿入至血管下，待血压、呼吸稳定后，轻轻结扎30 min，心电图显示ST 段抬高后，松开丝线恢复血流，持续120 min。假手术组只穿线，不结扎。参考文献[11]及预实验结果，香茅醛低、中、高给药组分别以50、100、150 mg·kg－1的剂量于造模前1 周进行灌胃，每日1 次，连续7 d，假手术组和模型组灌胃等量含5%乙醇的生理盐水。

2.2 组织病理学检测

将各组心肌组织用10%中性福尔马林固定过夜，脱水、石蜡包埋后切片，HE 染色，梯度脱水，封片，于20 倍光镜显微镜下观察。

2.3 心脏功能测定

分离大鼠右颈总动脉，将含0.1%肝素钠的导管缓缓插入左心室，利用Power Lab 生物信号采集处理系统实时监测大鼠左心室血流动力学的变化，评估心脏收缩及舒张功能。观察指标包括左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左心室等容期压力最大变化速率（±dP/dtmax）。

2.4 心肌损伤标志酶测定

复灌结束时，收集动脉血液至非抗凝管中，在4000 r·min－1、4℃条件下离心10 min，取上清液。按试剂盒操作步骤测定血清中LDH、CK-MB 活性。

2.5 氧化应激相关指标检测

低温环境下将心肌组织研磨成匀浆，以化学比色法检测组织匀浆液中SOD、CAT 以及GSHPx 活性，硫代巴比妥酸法检测MDA 含量，具体操作均遵循相关试剂盒说明书进行。

2.6 蛋白表达检测

取50 mg 大鼠心肌组织，使用RIPA 裂解液冰浴中裂解组织提取总蛋白，并采用BCA 法检测各组蛋白浓度。经12.5%SDS-PAGE 胶电泳分离蛋白样品后，采用半干转装置将蛋白转移至PVDF 膜上，将膜用含5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭1 h，用TBST 洗净残余封闭液，分别加入Nrf2、HO-1 和GAPDH 的一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗膜4 次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，再次洗膜4 次后用ECL 显色液进行显色，用化学发光凝胶成像仪拍摄图像并进行分析。

2.7 统计学处理

应用Graphpad Prism 6.0 统计软件进行数据分析，数据均以表示。多组间数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA），运用Dunnett’st检验比较两组之间的差异，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 香茅醛对大鼠MI/R 后心肌组织形态的影响

HE 染色后观察大鼠心肌组织，结果如图1所示，假手术组大鼠心肌细胞形态较为规则，结构完整、排列有序；模型组大鼠存在明显心肌纤维断裂情况，伴随大量炎性细胞浸润，部分细胞坏死、细胞质空泡化以及细胞外间隙增大等病理改变；香茅醛低剂量（50 mg·kg－1）组呈小灶性坏死，心肌细胞排列稀疏，横纹模糊，心肌间质中度肿胀，出现部分炎细胞浸润；香茅醛中剂量（100 mg·kg－1）组心肌组织横纹不清晰，心肌间质轻度肿胀，可见少量炎细胞浸润；香茅醛高剂量（150 mg·kg－1）组心肌细胞排列相对整齐，间质炎性细胞浸润明显减少，水肿减轻，形态较正常。结果提示，香茅醛能显著改善心肌组织病理损伤（见图1）。

图1 香茅醛对大鼠MI/R 后心肌组织形态的影响（×20）Fig 1 Effect of citronellal on the morphology of tmyocardial tissue in rats after MI/R（×20）

3.2 香茅醛对大鼠MI/R 后心脏功能的影响

如表1 所示，与假手术组比较，模型组大鼠LVSP 和＋dP/dtmax下降，LVEDP 和－dP/dtmax上升（P＜0.05），提示模型组大鼠心脏舒张功能和收缩功能明显受损；与模型组比较，香茅醛中、高剂量组LVSP 升高，香茅醛高剂量组＋dP/dtmax升高，香茅醛高剂量组LVEDP 和－dP/dtmax显著降低（P＜0.05），提示香茅醛预处理有改善MI/RI 后心肌收缩及舒张功能的作用。

表1 香茅醛对大鼠MI/R 后室血流动力学的影响 (x±s，n ＝10)Tab 1 Effect of citronellal on the hemodynamics in rats after MI/R (x ±s，n ＝10)

3.3 香茅醛对大鼠MI/R 后心肌损伤标志酶的影响

如表2 所示，与假手术组比较，模型组大鼠血清LDH、CK-MB 活性均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，香茅醛各剂量组血清LDH、CK-MB 的活性均降低（P＜0.05），提示香茅醛能减轻心肌细胞膜的损伤，降低心肌酶的漏出。

表2 香茅醛对大鼠MI/R 后血清LDH、CK-MB 的影响(x±s，n ＝10)Tab 2 Effect of citronellal on the levels of LDH and CK-MB in rats after MI/R (x±s，n ＝10)

3.4 香茅醛对大鼠MI/R 后氧化应激相关指标的影响

如表3 所示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织MDA 水平显著升高，而SOD、CAT 和GSH-Px 活性均显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，香茅醛中、高剂量组大鼠心肌组织MDA水平显著降低，而SOD、CAT 和GSH-Px 水平均显著升高（P＜0.05），提示香茅醛可以提高心肌组织的抗氧化能力。

表3 香茅醛对大鼠MI/R 后心肌组织氧化应激指标的影响 (x±s，n ＝10)Tab 3 Effect of citronellal on the oxidative stress indicators in rats after MI/R (x ±s，n ＝10)

3.5 香茅醛对大鼠MI/R 后抗氧化信号分子的影响

如图2 所示，与假手术组比较，MI/R 模型组大鼠心肌组织中Nrf2 和HO-1 蛋白水平应激性略有升高；与模型组比较，香茅醛中、高剂量组Nrf2 和HO-1 蛋白水平升高（P＜0.05）。

图2 香茅醛对大鼠MI/R 后抗氧化信号的影响Fig 2 Effect of citronellal on the antioxidant signaling after MI/R

4 讨论

MI/R 损伤常伴随出现心律失常、心脏功能紊乱，心肌损伤标志酶活性升高，心肌细胞内活性氧自由基产生等改变，最终导致心肌细胞坏死等不可逆的心肌损伤[3]。研究表明，香茅醛具有抗氧化、免疫调节功能[12-13]，在糖尿病心肌病与动脉粥样硬化的大鼠模型中都被证明能够抑制氧化应激，减少心肌损伤，改善血管内皮功能障碍[11，14]。

MI/R 损伤程度与心脏功能密切相关，血流动力学指标LVSP、LVEDP、±dP/dtmax是反应心脏收缩和舒张功能的重要指标[15]，本实验结果提示香茅醛可减少因缺血再灌注引起的心肌收缩与舒张功能障碍，尤其以改善心舒期功能为主。LDH对于机体能量代谢非常重要，主要催化乳酸脱氢后生成丙酮酸，在心肌组织中含量最高[16]。肌酸激酶（CK）与细胞内能量运输、肌肉收缩和ATP再生直接相关，催化肌酸和ATP 之间的转磷酸化反应[17]，在临床诊断中经常测定血清中其同工酶CK-MB 水平以反映肌肉萎缩或心肌梗死等病变。通过测定LDH 与CK-MB 活性可判断心肌细胞的损伤程度，本实验结果显示香茅醛能降低再灌注时血清中LDH 与CK-MB 的活性，进一步提示香茅醛很可能通过改善能量代谢而降低心肌细胞损伤。

研究表明，增强抗氧化能力可逆转氧化应激造成的心肌细胞与血管内皮组织的损伤，从而延缓或阻止MI/R 损伤的发生和发展[18-20]。通过检测组织中细胞膜脂质过氧化反应主要终产物MDA 的水平可直接反映其氧化程度，MI/R 等损伤因素诱发产生的大量超氧阴离子自由基会被SOD 转化为H2O2，继而H2O2在CAT 与GSH-Px 的作用下被催化生成H2O 和O2，从而减少氧化应激诱发的自由基连锁损伤，达到保护心肌的效果[21-22]。本实验中香茅醛可明显降低MDA 含量，并升高SOD、CAT及GSH-Px 水平，提示香茅醛可增强心肌组织的抗氧化能力，减少MI/R 诱发的氧化应激损伤，进而发挥对心肌的保护作用。当机体受到外界刺激时，会应激性地启动以Nrf2 为核心的内源性抗氧化防御系统，而天然存在的抗氧化物质（如酚类化合物）也会通过重要的转录因子Nrf2 促进抗氧化反应元件（ARE）的活化[23-24]，参与多种抗氧化酶基因如HO-1、谷胱甘肽转移酶（GST）、谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的调控，从而发挥抗氧化作用。本研究结果发现，当发生MI/R 时，Nrf2 与其下游HO-1 蛋白会应激性升高，给予中、高剂量的香茅醛干预后，两种抗氧化关键蛋白均显著升高，说明香茅醛可能通过Nrf2/HO-1 途径发挥抗氧化作用。

综上，香茅醛对MI/R 损伤有明显的保护作用。这种保护作用可能与香茅醛改善缺血/再灌注后心肌收缩与舒张功能，增强清除氧自由基能力，降低过氧化物的生成，减少氧化应激损伤有关，但其详细作用机制有待进一步研究。