2型糖尿病患者血浆miR-320b表达变化及其与糖代谢指标的相关性

邸亚男，马思思，陈彩凤，王志勇，王晋星一，汪峰

1 贵州医科大学第二附属医院，贵州黔东南州 556000；2 北京大学第三医院检验科；3 泰兴市人民医院内分泌科；4 泰兴市人民医院检验科

糖尿病已成为威胁全球人类健康最重要的非传染性疾病之一，我国更是已成为糖尿病患者增长最快的国家。据统计，我国糖尿病平均患病率为9.7%～11.6%，在某些省份甚至高达22.1%［1］。其中，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占90%～95%［2］。然而，目前T2DM 尚缺乏早期诊断指标。微小RNA（miRNA）是一类非编码内源性小分子RNA。越来越多的研究［3］证实，miRNA 是脂代谢和葡萄糖代谢的关键调节因子，有望成为糖尿病的诊断和治疗新靶点。课题组前期通过miRNA 芯片研究发现，在健康对照者、T2DM 前期患者和T2DM患者血浆中miR-320b水平依次降低，且ROC曲线显示其具有良好的诊断价值［4］。为了深入了解miR-320b 在T2DM 中的应用价值，本研究观察了T2DM患者血浆中miR-320b 的表达变化，并分析其与糖代谢指标相关性，为T2DM的早期诊断提供线索。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019 年9 月—2020 年9 月于蚌埠医学院附属泰兴市人民医院慢病科就诊的T2DM 患者30 例，记为T2DM 组；选取同期确诊的T2DM 前期患者29 例和体检健康者30 例，分别记为T2DM 前期组和健康对照组。T2DM 前期和T2DM 诊断符合中国T2DM 防治指南（2017 版）公布的相关诊断标准。T2DM 前期组和T2DM 组纳入标准：空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L 和/或口服葡萄糖耐量试验（OGTT）2 h 血糖≥11.1 mmol/L 者为T2DM 患者，6.1 mmol/L≤FPG＜7.0 mmol/L 者为T2DM 前期患者。排除标准：有T2DM 史或服用降糖药物史、急慢性炎症史、严重肝肾功能障碍及心脏疾病史、高血压、精神心理疾病、怀孕者及其他内分泌疾病患者。T2DM 组男16 例、女14 例，年龄49（43，54）岁；T2DM 前期组男17 例、女12 例，年龄49（32，56）岁；健康对照组男17 例、女13 例，年龄44（41，51）岁；三组间性别、年龄等基本资料具有可比性。

1.2 三组受检者血浆中miR-320b检测 采用qRTPCR 法。取三组受检者清晨空腹静脉血，分离得到血浆后，采用TRIzol 总RNA 提取试剂进行样本RNA提取，实验操作严格按产品说明书进行；使用Nano-Drop®ND-2000 测定所提取RNA 浓度和纯度，确保其纯度A260/A280 在1.8～2.1 间。利用变性琼脂糖凝胶电泳观察RNA 完整性。用miRNA cDNA 第一链合成试剂进行反转录，首先利用Poly（A）Polymerase（E. coli）对miRNA 进行加尾，之后对修饰后的miRNA 在反转录酶作用下进行反转录以合成cDNA 第一链。以cDNA 第一链为模板，按说明书配置qRT-PCR 反应体系，cDNA 2 µL，上下游引物各0.5µL，2×Master Mix 10µL，加纯水至20µL。按以下程序在荧光定量PCR 仪上进行检测：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸40 s，40个循环；扩增循环结束后，降温至60 ℃，然后加热升温至95 ℃变性DNA 产物。以U6 作为内参，引物序列如下：miR-320b 上 游 引 物 为5′-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCAA-3′，下游引物为5′-GGCCAACCGCGAGAAGATG-3′；U6 上 游 引 物 为5′-CTGCGCAAGGATGACACGCAAATT-3′，下 游 引 物 为5′-GGCCAACCGCGAGAAGATG-3′。以2-ΔΔCt表示血浆中miR-320b的相对表达量。

1.3 三组受检者糖代谢指标检测 取三组受检者清晨空腹静脉血，分离得到血浆后，采用葡萄糖氧化酶法在日立7180 全自动生化分析仪上检测FPG，采用高效液相离子交换色谱法在糖化血红蛋白全自动分析仪上检测糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c），采用化学发光方法在罗氏E601 电化学发光免疫分析仪上检测空腹胰岛素（FINS）。根据FPG和FINS 值计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛β细胞功能指数（HOMA-β），以评估患者胰岛素抵抗情况和胰岛β 细胞功能。HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，HOMA-β=（20×FINS）/（FPG-3.5）。

1.4 统计学方法 采用MedCalc15.2.2 软件。计量资料呈非正态分布时以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，多组间比较用Kruskal-Wallis 检验，两两比较用Post-hoc analysis 检验；相关性分析用Spearman 相关分析法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受检者血浆中miR-320b 相对表达量比较 T2DM 组、T2DM 前期组、健康对照组血浆中miR-320b 相对表达量分别为0.148（0.076，0.394）、0.447（0.080，0.926）、3.820（1.894，6.720），两两比较，P均＜0.05。

2.2 三组受检者糖代谢指标比较 三组受检者糖代谢指标比较见表1。由表1 可知，T2DM 组、T2DM前期组受检者血浆中FPG、HbA1c 水平及HOMA-IR均 高 于 健 康 对 照 组（P均＜0.05），FINS 水 平 及HOMA-β 均低于健康对照组（P均＜0.05）；且T2DM组受检者血浆中FPG、HbA1c 水平均高于T2DM 前期组（P均＜0.05），FINS 水平低于T2DM 前期组（P＜0.05）。

表1 三组受检者糖代谢指标比较［M（P25，P75）］

2.3 三组受检者血浆中miR-320b 相对表达量与糖代谢指标的相关性 Spearman 相关性分析结果显示，三组受检者血浆中miR-320b 相对表达量与HOMA-IR 负 相 关（r=-0.263，95%CI为-0.448～-0.056 7，P=0.013 3），与HOMA-β正相关（r=0.494，95%CI为0.317～0.638，P＜0.01），与FPG、HbA1c、FINS均无关（P均＞0.05）。

3 讨论

T2DM 是影响我国国民健康的重要慢性疾病之一，其防治至关重要。然而，对于T2DM，传统的诊断方式通常依赖于糖代谢指标如FPG、OGTT 实验和HbA1c 等，但当糖代谢指标异常时，患者往往已经存在胰岛素抵抗和/或胰岛β 细胞损伤，影响其早期诊断［5］。另外，这些常规指标并不能评估糖尿病相关并发症的发生风险。因此，寻找T2DM早期诊断和预测病情发展的生物标志物显得十分重要。

miR-320 家族具有高度的保守性，仅存在于脊椎动物中，该家族包括5个成员，分别为miR-320a、miR-320b、miR-320c、miR-320d 和miR-320e［6］。文献报道显示，miR-320 与多种脂代谢和糖代谢相关疾病如动脉粥样硬化［7］、糖尿病肾病［8］、糖尿病心肌损伤［9］等有关。miR-320b 基因位于人类1 号染色体上［10］。本研究结果显示，miR-320b 在健康对照者、T2DM 前期患者和T2DM 患者血浆中的表达水平依次降低，与前期研究结果一致［4］。进一步相关性分析发现，血浆miR-320b 水平与HOMA-IR 呈负相关，与HOMA-β 呈正相关。以上结果提示，miR-320b 可能通过影响胰岛β 细胞功能和胰岛素抵抗在T2DM 的发生发展中起着重要作用，并且可能作为T2DM 早期诊断生物标志物和治疗靶点。

然而，关于miR-320 在糖尿病时的水平变化，目前的研究结果并不完全一致。一项前瞻性研究［11］显示，在糖尿病前期患者和T2DM 患者血浆中miR-320水 平 较 低，且 联 合miR-15a、miR-126、miR-223和miR-28-3p 等miRNA 能较为准确的区分T2DM 患者和对照者。李华等［12］研究发现，老年人群T2DM患者的循环miR-320 水平较对照者低。孙志兵等［13］研究发现，T2DM 患者视网膜病变时时血清miR-320表达降低，且与病程进展及糖脂代谢指标相关，是发生糖尿病视网膜病变的危险因素。但是也有研究［14］发现，T2DM 患者的循环miR-320 水平较对照者高，且与空腹血糖呈正相关。遗憾地是，我们的研究中未发现miR-320b 与FPG 具有显著相关性。LING等［15］研究发现，与正常脂肪细胞相比，在胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞中miR-320表达上调。产生这种差异的原因可能是研究中所用的策略和方法不同，所用到的样本量较小，且研究人群具有差异。例如有些研究中，将同一组的样本混合后一起检测，这样可能导致某一样本水平的异常增高或降低导致了整组样本的改变。因此，有必要开展大样本量的前瞻性研究进一步确定miR-320b 是否能够作为糖尿病的诊断标志物。

综上所述，与体检健康者和T2DM 前期患者相比，T2DM 患者血浆中miR-320b相对表达量降低；血浆miR-320b 相对表达量与糖代谢指标HOMA-IR、HOMA-β 相关，miR-320b 可能作为T2DM 早期诊断及病情进展检测的生物标记物，但需要进一步大样本量前瞻性性研究确证。