黄芪治疗幽门螺杆菌相关性消化性溃疡的靶向自噬基因生物学功能分析及其核心基因筛选

仇婧玥，吴嫚婷，宋厚盼，3，喻昶，熊萌，孙启芳，茹凯月，隆采玲，曾梅艳

1 湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，长沙 410208；2 湖南中医药大学中医学院；3 湖南中医药大学中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室

消化性溃疡（Peptic Ulcer，PU）是我国是临床常见消化系统疾病，主要分为胃溃疡和十二指肠溃疡，患者以中上腹部反复发作的节律性疼痛为典型症状。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是导致PU 的最主要原因。Hp可利用自噬机制在胃黏膜细胞与巨噬细胞中长期存活，对机体进行慢性、持续性感染。对于Hp 相关性PU 患者，根除Hp 可促进PU 愈合、降低PU 并发症的发生率，明显降低PU 复发率。目前用于治疗Hp相关性PU的四联疗法存在服药时间长、患者依从性差、易使人体产生耐药性、溃疡易复发等问题，且长期服用抑酸剂会增加胃黏膜萎缩风险，导致罹患胃癌概率增加［1］。因此，从中医药寻找治疗Hp相关性PU的方药成为治疗该病的新思路。Hp相关性PU 在中医中属于为“胃痛”、“胃疡”范畴，其病位在胃，与肝、脾相关，多由气滞、血瘀、食滞致使胃体充血、水肿，络瘀血败而成，或因虚致胃黏膜失养而成。黄芪是一味温补中药，有补气升阳、托毒排脓、敛疮生肌等功效。在现代药理学中，黄芪具有提高免疫力、抗菌、抗溃疡等作用［2］。临床研究［3］表明，黄芪治疗Hp 阳性的PU 患者疗效显著，且安全性高、不良反应少。我们运用网络药理学与生物信息学方法，分析了黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬基因的生物学功能，寻找黄芪治疗Hp相关性PU 分子机制中可能涉及的自噬相关核心基因，为其应用于Hp 相关性PU 的临床治疗提供科学依据，为后续深入的实验研究提供思路和参考。

1 材料与方法

1.1 黄芪有效活性成分及其靶基因的筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP 平台，https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp. php）中 搜 索“黄芪”，得到黄芪的所有有效成分。以生物口服利用率（OB）≥30%且类药性≥0.18为筛选条件，筛选得到其中活性较高的成分，记为有效活性成分；并查阅文献，补充一些已被验证但在筛选时未被纳入的有效活性成分。基于获得的黄芪有效活性成分，利用TCMSP 平 台 和SwissTargetPrediction 平 台（http：//www. swisstargetprediction. ch/index. php）预测其作用靶基因。通过UniProt平台（https：//www.uniprot.org/）找到靶点对应的已验证的标准人类基因名，并剔除无对应基因的靶基因。

1.2 Hp 相关性PU 显著性差异表达基因的筛选在GEO 数据库（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）中以“Helicobacter pylori”为关键词检索，选择“Homo sapiens”为生物种类，Study Type 选择非编码RNA 相关的三种类型，即“Non-coding RNA profiling by array”、“Non-coding RNA profiling by genome tiling array”和“Non-coding RNA profiling by high throughput sequencing”，最 终 选 定GSE98641 数 据集［4］。该数据集实验平台为GPL18402，包含Hp感染胃黏膜巨噬细胞样本6 例，正常人胃黏膜巨噬细胞样本10例。选取其中处理时长为24小时的样本，样本编号为GSM2607444、GSM2607445、GSM2607446，未经Hp 处理的对照组编号为GSM2607450、GSM2607451、GSM2607452。通过R 软件中对选取的数据集数据进行均一化处理，获得Hp感染胃黏膜巨噬细胞与正常胃黏膜巨噬细胞的全部差异表达miRNA。在全部差异表达miRNA 中以P＜0.01 且｜log2FC｜≥2 为条件进行筛选，从中提取log2FC 最大的前五个上调miRNA 与log2FC 最小的前五个下调miRNA，获得显著性差异表达miRNA。在Star-Base（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）、miRTarBase（https：//mirtarbase. cuhk. edu. cn）中查找显著性差异表达miRNA 的靶基因，即为Hp 相关性PU显著性差异表达基因。

1.3 人类自噬基因的筛选 在人类自噬数据库（HADb 平台，http：//www.autophagy.lu/index.html）页面中点击“Clustering”，筛选人类自噬基因。

1.4 黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬基因的筛选 在Venny 2.1.0 平 台（https：//bioinfogp. cnb.csic. es/tools/venny/）页 面 中“List1”、“List2”、“List3”处分别输入黄芪有效活性成分作用靶基因、人类自噬基因和Hp 相关性PU 显著性差异表达基因，获得三者的交集基因，即为黄芪治疗Hp 相关性PU的靶向自噬基因。

1.5 黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬基因的基因本体（GO）分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析 将黄芪治疗Hp 相关性PU 的靶向自噬基因输入Metascape平台（https：//metascape.org/gp/index. html#/main/step1）中，以最小重叠数（Min Overlap）=3、P＜0.01、最小富集数（Min Enrichment）=1.5 为条件，分别做GO 分析和KEGG 富集分析。GO 分析是从生物学过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）三个层面分析基因的功能，KEGG 富集分析则分析基因的相关功能与在人体内参与的代谢通路。

1.6 黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬核心基因筛选 基因与基因之间存在复杂的交互网络关系，因此黄芪既可通过直接亦可通过间接的方式作用于自噬基因，而发挥治疗Hp 相关性PU 的作用。在STRING 平台（https：//string-db.org/）中输入黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬基因，逐个勾选与黄芪治疗Hp相关性PU靶向自噬基因直接或间接相关的拓展基因，构建黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬基因的蛋白质互作（Protein-protein interaction，PPI）网络，探究基因之间的相互关系。将PPI 网络导入Cytoscape3.7.1软件中，利用Cytohubba插件提供的MCC（Maximal Clique Centrality，最大集团中心性）算法筛选黄芪治疗Hp相关性PU的靶向自噬核心基因。

2 结果

2.1 黄芪有效活性成分及其靶基因的筛选结果在TCMSP 数据库中筛选获得黄芪有效活性成分20个，通过查阅文献补充已被证实的黄芪有效活性成分5个［2］，共获得黄芪有效活 性成分25个，包括（24S）-β-谷甾醇-5-烯-3β-醇、槲皮素、白桦脂酸、华良姜素、常春藤皂苷元、异鼠李素、3，9-二-O-甲基紫檀酚、5′-羟基异月桂醇-2′，5′-二-O-葡萄糖苷、7-O-甲基糖核素、黄芪异黄烷苷、美迪紫檀素、联苯双酯、芒柄花素、异黄烷酮、毛蕊异黄酮、山奈酚、叶酸、异木糖醇、异木糖醇-7，2′-二-O-葡萄糖苷、1，7-二羟基-3，9-二甲氧基紫檀烯、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ、黄芪多糖。利用TCMSP 数据库、SwissTargetPrediction 平台和UniProt 平台查找黄芪有效活性成分作用靶点及其对应基因，共获得黄芪有效活性成分的靶基因2 941个，包括E2F1、MPL、CDC25A、CA9、IL6等基因。

2.2 Hp 相关性PU 显著性差异表达基因的筛选结果 将从数据集中均一化处理后获得的2 027个miRNA 以P＜0.01 且｜log2FC｜≥2 为标准，筛选得显著性差异表达miRNA 90个，其中显著上调miRNA 55个，显著下调miRNA 35个。最显著的五个上调miRNA 是hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-28-5p，最显著的五个 下 调miRNA 是hsa-miR-371b-5p、hsa-miR-4788、hsa-miR-4758-5p、hsa-miR-2392、hsa-miR-188-5p。在StarBase 平台与miRTarBase 平台中查找10个最显著差异表达miRNA对应的靶点基因，共获得Hp 相关性PU 显著性差异表达基因2 109个。

2.3 人类自噬基因的筛选结果 筛选得到BIRC5、CAPN1、CASP1、CASP4、CDKN2A、CTSB、CTSD、DAPK1、EGFR、EIF2AK3等人类自噬基因232个。

2.4 黄芪治疗Hp 相关性PU 的靶向自噬基因筛选结果 共获得黄芪治疗Hp相关性PU的靶向自噬基因16个，分别为MYC、CASP3、RPS6KB1、CDKN1A、CCL2、BCL2、HDAC1、RB1、IKBKB、BAX、MAPK1、TP53、MAPK8、ATIC、BCL2L1、CASP8。

2.5 黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬基因的GO分析和KEGG 富集分析结果 GO 分析获得BP 相关条目434条，主要涉及凋亡信号通路、细胞程序性死亡的正调控、有丝分裂细胞周期G1/S 的转变、线粒体膜通透性的调节、肿瘤坏死因子的反应、对有毒物质的反应等过程；获得CC 相关条目16 条，主要涉及线粒体外膜、转移酶复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、核膜、神经元细胞体、质膜蛋白复合物等区域；获得MF 相关条目26 条，主要涉及蛋白质结构域特异性结合、BH3 域绑定、蛋白激酶活性、转录因子结合、激酶结合、细胞因子受体结合等功能。

KEGG 信号通路富集分析获得46 条通路，其中包括多种癌症相关通路，如癌症的通路、铂耐药、胃癌、病毒致癌、p53 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、ErbB 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等；参与调节细胞生长、分化、衰老、凋亡等生物学过程的相关信号通路，如神经营养素信号通路、鞘脂信号通路等；炎症相关通路，如NOD 样受体信号通路、IL-17 信号通路、Toll 样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路等。

2.6 黄芪治疗Hp 相关性PU 的靶向自噬核心基因筛选结果 黄芪治疗Hp相关性PU靶向自噬基因的PPI网络有314个节点、1 880条边，MCC 算法筛选获得TP53、CDKN1A、CCND1、CDK1、CDK2、CDK4、CCND2、E2F1、RB1、CCND3 等10个黄芪治疗Hp 相关性PU的靶向自噬核心基因（图1）。

图1 黄芪治疗Hp相关性PU的靶向自噬核心基因

3 讨论

研究［5］表明，Hp 作为PU 的主要致病因素，主要利用自噬机制在机体内长期存活。Hp 感染可诱导自噬发生，并在自噬体内进行复制。自噬可降解空泡毒素（VacA）和细胞毒素相关基因A（CagA），以抑制Hp 毒性，但长期接触VacA 可破坏自噬体。CagA可调控线粒体自噬，可能对自噬起负调控作用［6］。Hp 可通过调控microRNA 的表达，抑制自噬通路中多个核心基因的表达来抑制自噬。研究［7］显示，Hp的鞭毛能抑制巨噬细胞的自噬以逃避清除，Hp分泌的HP0175蛋白在Hp急性感染期间可以上调自噬相关基因的表达，诱导自噬。综上所述，自噬可降解VacA 和CagA 以抑制Hp 毒性，但Hp 长期在宿主体内存活会逐渐破坏细胞的自噬能力，使Hp及其有害产物无法被及时清除。此外，Hp 还可通过黏附作用、扰乱细胞凋亡与细胞周期及诱发炎症反应等多种途径诱导PU 的发生发展［8］，其对人体的持续感染会影响溃疡瘢痕的形成，导致PU迁延难愈。黄芪是治疗Hp 相关性PU 的常用中药。现代研究［2］表明，黄芪可增强巨噬细胞的吞噬作用，并显著抑制Hp VacA 活性［9］，但黄芪治疗Hp 相关性PU 的机制与自噬的关系尚不明确。

本研究筛选出包括槲皮素、白桦脂酸、华良姜素等25个黄芪中的有效活性成分及2 941个黄芪可能靶向作用的基因，并构建黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬基因的PPI网络，在Cytohubba中筛选出10个黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬核心基因TP53、CDKN1A、CCND1、CDK1、CDK2、CDK4、CCND2、E2F1、RB1、CCND3。其中TP53 是肿瘤相关基因，CDKN1A、CCND1、CDK1、CDK2、CDK4、CCND2、E2F1、RB1、CCND3都与调控细胞周期有关。

p53是TP53基因编码的蛋白。研究［10］表明，p53可通过调控自噬对肿瘤细胞产生影响，在营养匮乏等不良因素刺激下，p53通过抑制mTOR通路促进自噬；细胞核中的p53 诱导自噬，细胞质中的p53 抑制自噬。野生型p53 蛋白可通过调控microRNA，实现抑制肿瘤、调节细胞周期、诱导细胞衰老和凋亡等功能［11］，而TP53 基因突变产生的突变型p53 蛋白不仅失去野生型p53蛋白的功能，还促进肿瘤发展，甚至进一步抑制了野生型p53 蛋白的肿瘤抑制功能，这种突变存在于超过50%的癌症中［12］。实验证明，TP53 基因第72 密码子Pro/Pro 基因型可降低Hp 阳性胃溃疡患者的Hp根除率和胃溃疡愈合率，并可导致预后不良，增加患者的胃癌发生风险［13］。

与细胞周期调控有关的蛋白主要有三类，分别是细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKI），其中CDK 具有中心地位。各种信号通过影响Cyclin水平，使Cyclin与不同CDK结合并被激活，推动细胞周期的运行或转换。CKI 是CDK 抑制剂，可通过与CDK 或Cyclin-CDK 复合物结合对细胞周期进行调控。这些蛋白的异常表达可能导致肿瘤发生。CDK1、CDK2、CDK4 都属于CDK，作用于不同的细胞周期，CDK1 被发现在Hp 阳性与Hp 阴性的胃癌及癌前病变的患者中表达具有显著差异［14］；CDK1与CDK2 可作为判断胃癌预后的指标［15］；CDK4 的过表达可能在胃癌发生早期参与促进细胞恶性转化［16］。

RB1 基因可对细胞周期进行负调控，参与调节细胞衰老、凋亡等过程，并抑制肿瘤的发生发展。pRB 是RB1 编码的蛋白，是CDK 的激活底物，当细胞发生癌变时，pRB 可通过调控细胞衰老和细胞凋亡阻止恶性肿瘤的发生发展［17］。pRB 的磷酸化使E2F1 基因得以释放。E2F1 基因被发现参与包括细胞增殖及凋亡等多个过程，且在多种恶性肿瘤中呈高表达。研究［18］表明，E2F1 的异常表达可能在胃癌发生早期促进细胞的恶性转化，且其与p53 在胃癌的发生发展中起协同作用。同时，E2F1 可恢复被Hp VacA 抑制的树突状细胞的成熟过程［19］，而树突状细胞对胃癌患者的预后有积极作用。

CDKN1A 属于CKI，其编码的p21蛋白参与细胞分化、迁移、凋亡、转录、自噬等过程，且在不同细胞环境下常展现双重作用。研究［20］表明，p21 可激活自噬加速癌细胞死亡，也可抑制自噬诱导正常细胞凋亡。p21 受到p53 的激活，通过与CDK 结合，阻滞细胞周期而直接抑制细胞增殖，而低浓度p21 可在癌细胞中组合、激活Cyclin D 与CDK4的复合物促进增殖。p21 在细胞核中的表达常抑制肿瘤细胞增殖与迁移，而p21 在细胞质中的高表达常帮助肿瘤细胞发挥抗凋亡增益作用。在胃癌等多种癌症中，p21的下调与预后不良相关，而p21 的高表达常提示预后良好。

CCND1、CCND2、CCND3 属 于Cyclin。CCND1通过促使pRB 磷酸化、释放E2F1 来促进细胞增殖，并在帮助肿瘤细胞侵袭与转移中发挥作用［21］。在胃癌患者中，CCND1 阳性率与Hp 感染有正相关性［22］。CCND1 还可帮助胃癌的早期诊断［16］。研究［23］表明，CCND2的表达可能导致癌变，当CCND2表达产物定位于细胞核中时，胃癌组织分化程度高、浸润较浅，而CCND2表达产物定位于细胞质中时，胃癌组织分化程度低、浸润强且更易发生淋巴转移，提示预后不良。由此可见，本研究筛选出的自噬核心基因均与细胞周期、细胞凋亡的调控密切相关，提示黄芪可能通过调控自噬反应来调控细胞周期与细胞凋亡，最终起到治疗Hp相关性PU的作用。

本研究对黄芪治疗Hp 相关性PU 有关16个自噬基因做GO 功能富集分析，发现结果主要涉及细胞凋亡信号通路、有丝分裂细胞周期G1/S 的转变、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶活性等，基本与细胞凋亡、细胞周期以及炎症等领域有关。研究表明，Hp可干扰细胞正常增殖、凋亡及细胞周期，促使细胞从G1 期进入S 期，并停滞于S 期，从而抑制细胞增殖［8］；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物（TOR）可间接对自噬产生影响［10］；炎症反应是Hp 相关性PU 发病机制中的重要部分［24］，而黄芪可通过降低炎症因子水平、减轻炎性细胞浸润来发挥抗炎作用［25］。

在KEGG 通路富集分析中得到与Hp 相关性PU有关的通路46 条，其中较为显著的有癌症通路、细胞凋亡通路、NOD 样受体信号通路等。胃溃疡在多因素长期作用下可恶化为胃癌，其中Hp的持续感染是重要因素。Hp侵入机体后，在多种外膜蛋白帮助下黏附并定植于胃黏膜上皮细胞表面，其毒力因子VacA、CagA 等抑制自噬蛋白表达、破坏机体自噬能力、损伤胃黏膜，通过多种途径在宿主体内持续感染，使有害产物、受损细胞不能及时降解，最终引起胃病癌变。Hp 还可上调抑制抑癌基因、促进胃癌细胞发展的miRNA，下调能抑制胃癌细胞增殖转移的miRNA［26］，促进肿瘤发展。细胞凋亡通路在黄芪治疗Hp 相关性PU 中起重要作用。Hp 可使机体自噬与凋亡水平均上调。当自噬抑制时，Hp 可上调因自噬抑制引起的凋亡；当凋亡抑制时，Hp 可诱导细胞自噬性死亡［27］。而黄芪可通过激活自噬来抑制细胞凋亡［28］。NOD 样受体是病原识别受体，是组成机体先天免疫系统的重要部分，Hp 在胃黏膜定植后可刺激宿主免疫应答机制，NOD1、NOD2 通过与自噬蛋白ATG16L1 的相互作用将其募集到细菌入侵部位，触发自噬反应，发挥抗感染作用［29］，Hp 阳性患者体内NOD1、NOD2 的表达水平显著上升［30］。本研究结果进一步验证了前期已论证的实验结果。

综上所述，黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬基因可能通过细胞凋亡、细胞周期等生物学过程发挥作用，与癌症通路、细胞凋亡通路、NOD 样受体信号通路等信号通路有关；TP53、CDKN1A、CCND1、CDK1、CDK2、CDK4、CCND2、E2F1、RB1、CCND3 等10个基因可能是黄芪治疗Hp 相关性PU 靶向自噬核心基因。本研究运用网络药理学与生物信息学方法探究黄芪治疗Hp 相关性PU 的分子网络调控机制，挖掘了黄芪治疗Hp 相关性PU 涉及的核心自噬基因，发现黄芪治疗Hp 相关性PU 的分子机制可能与激活机体自噬反应以增强胃黏膜对Hp 自噬从而抑制其慢性持续性感染有关。本研究结果可为将黄芪或含黄芪的中药复方应用于Hp相关性PU的临床治疗提供科学依据，为后续深入的实验研究提供思路和参考。