基于生物3D 打印技术的芍药苷-海藻酸钠-明胶皮肤支架体外生物相容性研究

余海洋， 游德淑， 顾晓诚， 梅峻豪， 秦立昊， 王 凯， 刘 纯， 王 云， 贾中芝

糖尿病足部溃疡导致的创面新生血管形成不良、局部炎性反应、血小板聚集等加重了创面局部细胞损伤，进而形成难治性创面，已成为临床上棘手的难题［1-3］。 芍药苷是一种中药单体成分，具有抗炎、镇痛、镇静、保护细胞活性、免疫调节等多种作用，广泛应用于临床［4-6］。 近年来，生物3D 打印技术逐渐应用于人工皮肤支架制备［7-9］。本研究采用生物3D 打印技术， 将芍药苷与海藻酸钠（sodium alginate，SA）、明胶制成人工皮肤支架，并对其生物相容性进行评价，以期为糖尿病足部慢性创面的修复提供一种中药生物3D 打印皮肤支架， 促进糖尿病足部慢性创面愈合。

1 材料与方法

1.1 皮肤支架制备

生物墨水制备：将一定量的芍药苷完全溶解于20 mL 去离子水，然后加入0.8 g SA 粉末及装有2 g明胶颗粒的烧杯中，40℃水浴电磁搅拌2 h，按照芍药苷的质量占明胶与SA 总重百分比（wt%）分别制成0、1、3、5、10%的生物3D 打印墨水。

采用生物3D 打印机（瑞士RegenHU 公司）及其配套BioCAD 软件设计的模型（15 mm×15 mm，厚度4 层，间距0.8 mm），将生物墨水加入3D 打印机热熔针筒中，针筒加热至40 ℃，然后调节为37℃恒温，气压0.25 MPa，距离2 mm，打印速度6 mm/s，针头25 G，分别打印出0、1、3、5、10%芍药苷-SA-明胶的皮肤支架。

1.2 皮肤支架药物释放

将透析袋（截留相对分子量3 500）置于沸水中煮10 min，待其活化后剪成半透膜，固定于扩散池的供给池与接受池之间； 向接受池中加入14.8 mL已预热至35℃的0.9%氯化钠溶液作为接受液，注意排除气泡。转速为200 r/min，向供给池中加3 mL 0.9%氯化钠溶液并封口， 将样品浸在200 μL 0.9%氯化钠溶液中，30 min 后供给池中加完0.9%氯化钠溶液及处理后的样品35 mg，立刻启动透皮仪并开始计时； 分别于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h 时点取出0.6 mL 接受液，置于离心管中，加入0.6 mL 35℃0.9%氯化钠溶液并排除气泡。 样品12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，过0.22 μm 滤膜后用液相色谱仪检测。 色谱条件：①流动相，甲醇∶0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液为32∶68； ②检测波长，230 nm；③流速，1.0 mL/min；④柱温，30℃。

1.3 皮肤支架生物相容性

将皮肤支架与大鼠皮肤成纤维细胞共培养3 d后，行Live/Dead 染色，荧光显微镜下观察皮肤支架表面细胞存活和黏附情况， 扫描电子显微镜（SEM）下观察皮肤支架表面细胞黏附和生长情况。

将大鼠皮肤成纤维细胞与皮肤支架置入24 孔板中，4×104/孔密度种植，共培养1、2、3 d，加入细胞计数试剂盒（CCK）-8 中检测细胞增殖情况；检测羟脯氨酸和白细胞介素（IL）-6 表达水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析。 所有实验至少重复3 次，最后取实验数据平均值，以均数±标准差表示， 组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮肤支架宏观和微观结构

肉眼观：5 种规格皮肤支架均呈网格状，孔径均匀（图1）。 SEM：5 种规格皮肤支架均为多孔网状立体结构， 孔隙均匀，3%组皮肤支架表面较其他4 组光滑（图2）。

图1 不同规格芍药苷-SA-明胶皮肤支架的宏观形貌

2.2 皮肤支架药物释放

药物累积释放量随着时间延长逐渐增加，10 %皮肤支架组在各时点的释放均高于其他4 组（图3）。

2.3 皮肤支架细胞黏附和增殖

Live/Dead 染色： 细胞与皮肤支架共培养3 d后， 在各组皮肤支架表面均能较好地黏附与生长，但3%组皮肤支架活细胞数多于其他4 组；SEM：细胞与皮肤支架共培养3 d 时， 细胞能在皮肤支架表面黏附和生长，见图4。

图3 皮肤支架药物释放曲线

图2 SEM 下不同规格芍药苷-SA-明胶皮肤支架的表面形貌

图4 大鼠皮肤成纤维细胞在5 组皮肤支架表面生长情况

CCK-8 检测细胞增殖率： 在1 d 时，0、1、3、5、10%组分别为（0.47±0.04）%、（0.39±0.02）%、（0.39±0.01）%、（0.38±0.02）%、（0.39±0.02）%，0 组显著高于1、3、5、10%组（P=0.045、0.035、0.032、0.032），1、3、5、10%组间差异无统计学意义（均P＞0.05）；2 d 时，0、1、3、5、10%组分别为（0.54±0）%、（0.41±0.02）%、（0.40±0.02）%、（0.41±0.01）%，0 组显著高于其他4 组（均P＜0.01），1、3、5、10%组间差异无统计学意义（均P＞0.05）；3 d 时，0、1、3、5、10%组分别为（0.74±0.01）%、（0.74±0.05）%、（0.85±0.05）%、（0.7±0.05）%、（0.56±0.04）%，3%组显著高于0、1、5、10%组（P=0.022、0.048、0.020、0.002），见图5。

图5 大鼠皮肤成纤维细胞增殖水平

2.4 皮肤支架对羟脯氨酸分泌的影响

细胞与皮肤支架共培养后羟脯氨酸分泌水平：1 d 时，0 组［（2.51±0.03） μg/mL］显著低于3%组［（2.73±0.06）μg/mL，P=0.006］、5%组［（2.77±0.12）μg/mL，P=0.020］；2 d 时，0 组［（4.21±0.10） μg/mL］显著低于1%组［（5.19±0.28） μg/mL，P=0.005］、3%组［（5.13±0.23） μg/mL，P=0.003］、5%组［（4.79±0.33） μg/mL，P=0.043］、10 %组［（5.11±0.10） μg/mL，P＜0.01］；3 d 时，3%组［（6.24±0.34） μg/mL］显著高于0 组［（4.93±0.12）μg/mL，P=0.003］、1%组［（5.66±0.17）μg/mL，P=0.030］、5%组［（5.28±0.17） μg/mL，P=0.012］、10%组［（5.34±0.41） μg/mL，P=0.042］，见图6。

图6 羟脯氨酸分泌水平

2.5 皮肤支架对IL-6 分泌的影响

细胞与皮肤支架共培养后IL-6 表达水平：1 d时，0、1、3、5、10%组分别为（141.77±16.19） pg/mL、（150.32±0.69）pg/mL、（136.77±15.03）pg/mL、（116.99±10.12） pg/mL、（56.21±8.04） pg/mL，10 %组显著低于其他4 组（均P=0.001）；2 d 时，0、1、3、5、10%组分别为（177.88±8.00）pg/mL、（158.66±11.86）pg/mL、（146.66±14.51）pg/mL、（136.32±4.91）pg/mL、（127.21±3.34）pg/mL，0 组高于3%组、5%组、10%组（P=0.031、0.002、0.001），1 组高于5%组、10%组（P=0.040、0.011）；3 d 时，3%组［（165.1±1.73） pg/mL］显著低于0 组［（231.21±10.59） pg/mL，P＜0.01］、1%组［（180.77±2.08） pg/mL，P ＜0.01］， 显著高于10%组［（142.54±1.54） pg/mL，P＜0.01］，见图7。

图7 IL-6 表达水平

3 讨论

随着我国糖尿病患者逐年增多，糖尿病足溃疡发病率逐年升高，其治疗已成为临床上巨大挑战［10-12］。人工皮肤在糖尿病足溃疡救治过程中发挥着重要作用［13］。近年来生物3D 打印技术飞速发展，通过该技术能快速获得个性化的人工皮肤支架，逐渐在糖尿病足溃疡救治方面展现出独特优势，但目前基于生物3D 打印技术获得的皮肤支架仍处于起始阶段，需要深入研究［13-14］。

生物3D 打印技术的关键是生物墨水选择与制备，目前常用于生物墨水的材料有海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、壳聚糖等，这些材料各有优缺点［7］。 本研究采用SA、明胶及芍药苷作为生物墨水成分，主要优点是：SA 作为一种天然多糖，具有高稳定性、溶解性、黏性和安全性等特点［15］；明胶具有较高的生物相容性和可降解性， 其在体内降解后不产生副产物，无免疫原性［16］；芍药苷具有抗炎、镇痛、镇静、保护细胞活性、免疫调节等多种作用，不但在糖尿病肾病、 糖尿病视网膜病变的防治中得到广泛应用，还在糖尿病足溃疡创面愈合过程中发挥着重要作用［4-6］。 本研究初步验证了应用SA、明胶、芍药苷制作生物墨水，可获得较为理想的皮肤支架。 虽然在宏观方面无法区分5 组支架， 但在微观结构上，3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架较其他4 组支架明显光滑，这种结构方面的差异，可进一步影响细胞生长黏附， 从而证实3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架组较其他4 组支架更加适宜细胞生长。

羟脯氨酸是构成结缔组织中胶原蛋白的主要成分之一，在促进糖尿病足溃疡创面修复过程中发挥着极其重要的作用［17］。胶原蛋白具有低免疫原性、良好的生物相容性，可促进创面修复，维持新生肉芽组织弹性和强度等功能，其量的多少直接影响糖尿病足溃疡创面修复过程［18］。本研究证实，3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架组羟脯氨酸分泌量显著高于其余4 组（与前面证实的该支架更适宜细胞生长的结果一致）。 这也与芍药苷药物浓度有关，随着累积释放量增加，其抗炎作用增强的同时也对细胞产生一定的杀伤作用，细胞数量多少是影响羟脯氨酸释放量的因素之一。 因此，3%芍药苷-SA-明胶组皮肤支架具有较高的生物相容性， 并可促进胶原蛋白分泌，从而加速糖尿病足溃疡创面愈合。

IL-6 是成纤维细胞产生的细胞因子之一，在炎性反应过程中起着重要作用［19］。 炎性细胞和炎性因子浸润导致了糖尿病足溃疡创面难以愈合。 本研究发现10%芍药苷-SA-明胶皮肤支架的IL-6 表达水平显著低于其余4 组， 说明芍药苷可很好地抑制IL-6 释放，减轻局部炎症反应，但其细胞毒性也随着药物浓度的增加而增大［20］，而3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架在降低局部炎症反应的同时具有较低的细胞毒性，可有效抑制支架局部炎症反应，从而加快糖尿病足溃疡创面修复。

糖尿病足溃疡创面愈合是一极其复杂的过程，包括抑制炎症反应、胶原蛋白沉积、新生表皮成纤维细胞增殖、血运重建等［21］。 本研究针对影响糖尿病足溃疡修复的主要因素进行的体外研究，发现3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架可促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白释放，同时可有效抑制炎症反应，希望可为糖尿病足溃疡创面修复提供一种理想的皮肤支架。

本研究不足：仅进行体外实验研究，未进行体内验证，下一步将开展糖尿病大鼠慢性创面的动物实验， 以验证以上理论；SEM 下观察5 组皮肤支架上的细胞数量明显减少，可能与皮肤支架的脱水处理会引起细胞脱落有关；3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架的降解时间曲线，仍需要进一步研究。