下肢动脉硬化闭塞症患者支架植入术后血清miR-140-5p 与1 年内支架内再狭窄相关性研究

张 克， 杨 涛， 郝 斌

下肢动脉硬化闭塞症（lowerextremityatherosclerotic occlusive disease，LEAOD）是下肢动脉粥样硬化斑块堵塞血管，致使下肢慢性缺血、缺氧的综合征［1］。血管内介入治疗作为一种微创术式，已广泛应用于LEAOD 治疗，可有效改善肢体缺血、缺氧情况［2］。 但经长期临床观察，LEAOD 患者经血管内介入治疗后支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）发生率较高，普通金属支架ISR 发生率在15%～30%，即使应用药物洗脱支架，其ISR 发生率也在10%左右［3］。 因此，探究预示ISR 的指标有着重要意义。 目前关于ISR 病理生理机制还未完全阐明， 可能与血管内皮损伤、动脉粥样硬化、炎症、血管平滑肌细胞异常增殖和迁移等有关［4］。 有研究显示， 微小核糖核酸（miR）-140-5p 可靶向toll 样受体4， 抑制氧化型低密度脂蛋白诱发的氧化应激和细胞凋亡，干扰动脉粥样硬化斑块形成［5］，因而认为miR-140-5p 参与了LEAOD 支架植入术后ISR 过程。目前鲜有研究分析miR-140-5p 与LEAOD 支架植入术后ISR 的关系。本研究选取LEAOD 患者作为研究对象， 分析miR-140-5p 与支架植入术后1 年内ISR 的关系，以期为ISR 预防和治疗提供帮助。 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

参照《下肢动脉硬化闭塞症诊治指南》［6］诊断LEAOD，就诊患者有间歇性跛行、静息痛或麻木等症状，踝-肱指数（ABI）＜0.9，经CTA 检查确诊为LEAOD。 选取2019 年2 月至2020 年3 月在山西白求恩医院接受支架植入术治疗的136 例LEAOD 患者作为研究对象。纳入标准：①首次确诊为LEAOD；②符合支架植入手术指征；③年龄＜80 岁；④配合完成研究相关事宜。 排除标准：①伴肝、肾功能或凝血功能异常；②伴大动脉炎、高同型半胱氨酸血症、恶性肿瘤、慢性阻塞性肺疾病或骨关节炎等；③术后未遵医嘱服用抗血小板聚集药物； ④临床资料不完整。 本研究符合赫尔辛基宣言，所有受试者均签署手术知情同意书，并经医院医学伦理委员会批准。

1.2 支架植入术治疗方案

术前行常规检查，包括血常规、尿常规、血生化、凝血功能等。 采用Seldinger 法穿刺股动脉，CTA检查后行球囊扩张血管成形术， 根据血管病变位置、 长度等选择大小适宜的同种类型支架并植入，然后依次撤出导丝、导管，最后拔出动脉止血鞘管，局部加压止血。术后口服氯吡格雷（75 mg/d）和阿司匹林（100 mg/d）6 个月，此后口服阿司匹林。

1.3 临床指标和随访

收集患者年龄、性别、体质量指数（BMI）、糖尿病史、高血压史、高脂血症史、冠心病史、缺血性脑卒中史、Fontaine 分期、 泛大西洋学会联盟（TASC）Ⅱ分型、 抗血小板聚集药物服用情况、 空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和C 反应蛋白（CRP）等指标。

采用复诊方式了解术后患者ISR 发生情况，每6 个月1 次，共2 次。行下肢动脉超声检查了解ISR和支架脱落等情况， 必要时行CTA 检查。 共随访150 例患者，其中14 例失访，失访率为9.3%，未将失访患者纳入研究分析。 随访过程中无死亡患者。 ISR定义：原支架植入两端5 mm 内血管腔内径狭窄≥50%。

1.4 miR-140-5p 表达检测

采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）［7］检测患者血清miR-140-5p 表达。 抽取患者支架植入术前后（出院前、术后7 d）肘部静脉血10 mL，离心后取上清液，置于Eppendorf 管（EP）中-80℃保存待验。 实验步骤：取出EP，解冻后用RNA 提取试剂盒（日本TaKaRa 公司）提取总RNA，紫外分光光度计（上海光学仪器五厂有限公司） 检测RNA 纯度，吸光度值比（OD260/280）在1.9～2.0；取2 μg RNA，用反转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）将其转录为cDNA；用PCR 仪（美国Thermo Fisher 科技公司）扩增cDNA，反应条件为95℃10 min，95℃60 s，35 个循环，60℃60 s，72℃60 s。 选取10 名年龄、性别与LEAOD 患者匹配的健康体检者作为对照，2-DDCt 法计算LEAOD 患者miR-140-5p 相对表达量。 miR-140-5p和内参U6 序列见表1。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件包进行统计学分析。 计量资料行Shapiro-Wilk 检验， 正态分布的以均数±标准差表示，两组间比较用独立样本t 检验；非正态分布的以M（P25，P75）表示，两组间比较用Mann-Whitney U 检验；两组间术前、术后miR-140-5p 相对表达水平比较用重复测量方差分析。 计数资料以例（%）表示，两组间比较用χ2检验。 采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）评价miR-140-5p 预判支架植入术后1 年内ISR 的价值，logistic 回归分析miR-140-5p 与支架植入术后1 年内ISR 的关系。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LEAOD 患者临床特征

136 例LEAOD 患者中男88 例，女48 例；年龄50～78（59.9±6.1）岁；BMI 为（23.8±2.6） kg/m2；有高血压史68 例，糖尿病史38 例，高脂血症史106 例，冠心病史37 例，缺血性脑卒中史32 例；血管病变均位于股腘动脉段；Fontaine 分期Ⅱ期10 例， Ⅲ期88 例，Ⅳ期38 例；TASCⅡ分型A 型81 例，B 型39 例，C 型16 例。 支架植入术后1 年内有52 例（38.24%）发生ISR（ISR 组），84 例（61.76%）未发生ISR（非ISR 组）。

2.2 两组临床特征比较

两组患者年龄、性别构成比，BMI、高血压史、糖尿病史、高脂血症史、冠心病史、缺血性脑卒中史占比，Fontaine 分期构成比差异无统计学意义（均P＞0.05）。 ISR 组TASCⅡ分型B+C 型占比高于非ISR组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组临床特征比较

2.3 两组实验室指标比较

两组患者FBG、TC、TG、HDL-C 水平差异无统计学意义（均P＞0.05），ISR 组LDL-C、CRP 水平高于非ISR 组（均P＜0.05），见表3。

表3 两组实验室指标比较 （x±s）

2.4 两组miR-140-5p 相对表达比较

两组间miR-140-5p 相对表达水平差异有统计学意义（F=42.316，P＜0.001）；ISR 组miR-140-5p 相对表达水平在术前、术后均低于非ISR 组（均P＜0.05），术前与术后差异有统计学意义（F=467.020，P＜0.01）；两组术后miR-140-5p 相对表达水平均分别高于术前（均P＜0.05），其时间与ISR 间存在交互效应（F=6.158，P=0.014）；ISR 组miR-140-5p 相对表达升高程度低于非ISR 组（P＜0.05），见表4。

2.5 miR-140-5p 预判支架植入术后1 年内ISR 价值

术前miR-140-5p、术后miR-140-5p、miR-140-5p差值预判支架植入术后1 年内ISR 的ROC 曲线下面积（AUC）、最佳截断点、灵敏度、特异度，分别为0.639（95%CI：0.542～0.736）、0.58、48.08%、78.57%，0.824（95%CI：0.757～0.892）、0.94、80.77%、70.24%，0.617（95%CI：0.520～0.715）、0.28、71.15%、52.38%。术前miR-140-5p 与miR-140-5p 差值间预判支架植入术后1 年内ISR 的AUC 差异无统计学意义（Z=0.234，P=0.815）， 术后miR-140-5p 预判支架植入术后1 年内ISR 的AUC 高于术前miR-140-5p（Z=3.012，P=0.003）、miR-140-5p 差值（Z=5.274，P＜0.01），见图1。

表4 两组miR-140-5p 相对表达比较

2.6 支架植入术后1 年内ISR logistic 回归分析

将支架植入术后1 年内是否发生ISR 作为因变量，性别、TASCⅡ分型、LDL-C、CRP 和术后miR-140-5p 作为自变量（纳入标准为P＜0.10，赋值见表5）纳入多因素logistic 回归分析， 结果显示TASCⅡ分型、LDL-C、CRP 是LEAOD 患者支架植入术后1 年内ISR 的独立危险因素（均P＜0.05），术后miR-140-5p是术后1 年内ISR 的独立保护因素（P＜0.05），见表6。

表5 自变量赋值情况

表6 logistic 回归分析支架植入术后1 年内ISR 结果

3 讨论

ISR 严重影响着LEAOD 介入治疗预后， 是临床急需解决的问题之一。 探究预示ISR 的指标有着重要意义。目前已有多数miRNA 被报道参与了LEAOD发病和进展过程， 如miR-342-5p、miR-29a 和miR-143［8-10］等。 本研究主要分析miR-140-5p 与LEAOD患者支架植入术后1 年内ISR 的关系，结果显示ISR发生率为38.24%，与徐永平等［11］研究结果（33.82%）接近；ISR 组术前和术后miR-140-5p 相对表达均低于非ISR 组，两组术后相对表达均高于术前，ISR 组升高程度低于非ISR 组，提示miR-140-5p 与LEAOD患者支架植入术后1 年内ISR 有关，或可作为辅助预判ISR 的潜在生物标志物；ROC 曲线分析结果显示术后miR-140-5p 预判支架植入术后1 年内ISR的AUC、灵敏度、特异度分别为0.824、80.77%、70.24%，其预判价值高于术前miR-140-5p 和miR-140-5p差值，提示术后miR-140-5p 对于LEAOD 患者支架植入术后1 年内ISR 有一定预判价值，可辅助用于ISR 诊断。

进一步采用logistic 回归分析显示， 术后miR-140-5p 是LEAOD 患者支架植入术后1 年内ISR 的独立保护因素。推测其原因：miR-140-5p 可靶向toll样受体4， 抑制氧化型低密度脂蛋白诱发的氧化应激和细胞凋亡，干扰动脉粥样硬化斑块形成，其表达水平与动脉粥样硬化斑块形成有关，进而反映支架植入术后1 年内ISR 情况；miR-140-5p 还被报道参与多种炎症性疾病，如骨关节炎［12］、脑出血诱发的神经炎症［13］等，其可能通过调节炎性反应参与ISR 发生过程， 因此其表达水平可反映ISR 发生情况。本研究结果还显示TASCⅡ分型、LDL-C 和CRP均为LEAOD 患者支架植入术后1 年内ISR 的独立危险因素，与既往一些研究结果一致［14-16］；糖尿病与术后1 年内ISR 无关， 与上述研究结果不一致，推测可能与样本量大小、区域等因素有关，还需开展大样本、多中心研究予以验证。 支架植入数量和支架直径等因素也或与ISR 有关，但本研究未纳入这些因素进行分析，原因在于支架植入数量取决于患者血管病变支数， 支架直径取决于血管狭窄程度，而TASCⅡ分型包含上述内容。

图1 miR-140-5p 预判支架植入术后1 年内ISR 的AUC

本研究尚存在一定不足，仅分析了术前、术后miR-140-5p 与LEAOD 患者支架植入术后1 年内ISR 的关系，未确定最佳时点的miR-140-5p 用于诊断。 对于接受球囊扩张治疗患者术后miR-140-5p是否可用于ISR 评价仍未可知，还需开展研究予以验证。 本研究结果与既往研究结果有略微差异，后续将开展大样本、多中心研究进行验证分析。