红铃虫成虫对4 种中药材提取物的电生理及嗅觉反应

尹海辰，许冬，武怀恒，丛胜波，杨甜甜，万鹏

（农业农村部华中作物有害生物综合治理重点试验室/ 农作物重大病虫草害防控湖北省重点试验室/ 湖北省农业科学院植保土肥研究所，武汉 430064）

红铃虫（Pectinophora gossypiella），属鳞翅目（Lepidoptera）麦蛾科（Gelechiidae），是世界上十分重要的棉花害虫之一[1]。21 世纪以前，红铃虫在我国长江流域棉区为害十分严重，导致棉花产量损失10%～30%，严重影响了我国棉花产业的发展[2]。 2000 年后，我国长江流域开始种植转cry1Ac基因棉花，使红铃虫的发生与危害得到了有效抑制[3]。然而，在印度、巴基斯坦等国家，因为没有很好地执行庇护所策略，目前已有红铃虫对抗虫棉产生抗性的相关报道，例如在印度，红铃虫对转cry1Ac＋cry2Ab棉的抗性已被证实普遍存在[4]。因此，开展红铃虫综合防控技术研究对于延缓其抗性发展具有十分重要的意义。

寄主植物产生的次生代谢物能够影响昆虫对寄主植物的发现、识别、定位、取食、产卵等行为[5-8]。 利用这一特性开发的各种引诱和驱避技术，已成为害虫监测与防治中极具应用前景的新技术[9-10]。充分利用各类植物资源是研发此类技术的基础。 在我国，中草药是一类重要的植物资源，能产生极其丰富的次生代谢物，是开发各类昆虫引诱或驱避剂的良好原材料。 目前虽未见红铃虫危害中药材植物的报道，但已有研究证实一些中药材提取物可以引起棉田害虫如绿盲蝽（Apolygus lucorum）和中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis）的嗅觉反应[11]。 本研究以香气浓郁的4 种中药材植物花 椒 （Zanthoxylum bungeanum）、 黄 柏（Cortex phellodendri）、云木香（Saussurea costus）、五倍子（Rhus chinensis）的主要药用部位提取物为对象，研究了红铃虫对这些提取物的电生理和嗅觉反应， 并选择鳞翅目害虫常见引诱剂芳樟醇与这4种中草药提取物进行复配， 进一步提升嗅觉反应，以期为红铃虫监测与防治新技术的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4 种供试中草药原材料为风干的云木香（根）、花椒（果实）、五倍子（虫瘿）、黄柏（树皮），均采购自湖北省武汉市中药材市场。 无水乙醇（质量分数99.7%）采购自国药集团化学试剂有限公司，芳樟醇（质量分数98%）采购自罗恩化学品试剂公司。

本研究所用的红铃虫采集自湖北省武汉市、鄂州市等地棉田，在室内（26±1）℃、光周期（光/暗时间）16 h/ 8h、相对湿度60%条件下用人工饲料[12]饲养多代。 触角电位与嗅觉反应试验选用1～3 日龄健康红铃虫成虫，试验开始前将供试棉铃虫（试虫）饥饿处理4 h。

1.2 仪器

所用触角电位仪采购自Syntech 公司（德国）， 信号控制器为IDAC-2， 气味源控制器为CS-55。

1.3 方法

1.3.1供试中草药提取物的制备。 中草药提取物制备方法参考李秀梅等[13]的报道，并有所改进。将风干的中药材用粉碎机磨制成干粉， 称取100 g粉末置于250 mL 无水乙醇中室温密封浸泡15 d后用布氏漏斗过滤，滤去药渣后获得上清液。 将上清液用旋转蒸发仪在45 ℃、20～30 r·min-1条件下水浴加热蒸干溶剂，获得提取物，并保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2红铃虫触角电位图（electroantennogram,EAG）试验。 试验方法参考董文霞等[14]的报道，并有所改进。 测定时用无水乙醇将提取物稀释为15 g·L-1和1.5 g·L-1，对照组为无水乙醇。 取15 μL 溶液滴于30 mm×10 mm 的滤纸上，将滤纸塞入1 000 μL 移液枪枪头中，连接刺激气体控制装置。 保持送气管管口与触角纵向垂直，并与触角相距10 mm 左右。用解剖刀从基部切下雌性和雄性成虫的整个触角， 并切除少量触角尖端。将直径约0.2 mm 的银丝电极插入到玻璃毛细管中， 电极内径注入适量浓度为0.9 mol·L-1的电生理盐水。 将切下的触角连接于2 个电极上，每次刺激时间为0.5 s，2 次刺激之间间隔30 s，以保证触角感觉器感觉功能的完全恢复。 每种提取物与对照溶液交替刺激触角，取前后对照的平均值作为该提取物每次刺激值的对照值。 雌性和雄性红铃虫各测试8 根触角，每根触角用每种提取物刺激3 次。 采用成虫对提取物的触角电位反应幅度除以前后对照的平均值来计算EAG 反应的相对值。

1.3.3红铃虫嗅觉反应试验。 将2 个直径4 cm、高3 cm 的圆形养虫盒（开口向上）放入长、宽、高分别为20 cm、15 cm、5 cm 的长方形塑料养虫盒两端，并在圆形养虫盒内放入1 张滤纸。 将花椒或云木香提取物用30 μL 无水乙醇溶解成糊状，再用无菌水将其稀释为15 g·L-1， 将1 mL 提取物溶液加入其中1 个圆形养虫盒内作为处理组，对照组为30 μL 无水乙醇用无菌水稀释为1 mL，加入另一端的圆形养虫盒内。 每日17：00 将20头雌性或雄性红铃虫成虫冷昏迷后放入长方形养虫盒正中间处，为防止养虫盒两侧气味聚集在盒底部相互混合产生干扰，盒顶部用透气纱布覆盖，使提取物气味可以自由挥发至盒外。 试验在黑暗环境中进行，次日08：00 观察记录成虫选择情况，成虫进入装有某一气味源的圆形养虫盒内或位于反应区则记为对该气味源产生选择反应（图1）。 为防止气味源方向或试虫个体差异造成的影响，本试验重复6 次，共计测试雌虫和雄虫各120 头，每次重复均更换一批新试虫，并更换处理组气味源与对照组气味源方向，每次试验结束后将养虫盒用无水乙醇擦洗。

图1 嗅觉反应试验装置示意图Fig. 1 Schematic diagram of olfactory response experiment device

1.3.4棉花植株对提取物引诱作用的影响。 选择1.3.3 试验中筛选出的具有引诱作用的提取物，测试其在存在寄主植物棉花叶片气味条件下对红铃虫的引诱作用。 将2 个金字塔形养虫笼（底面25 cm×25 cm，高度40 cm，外部覆盖透气纱布）用玻璃管（长20 cm，直径10 cm）连接（图2）。 其中1 个养虫笼内放入1 盆棉花苗期植株，另一笼中放入1 张白色黏虫板（20 cm×15 cm）。 处理组为提取物按照1.3.3 试验中方法溶解后， 取100 μL于1.5 mL 离心管（EP 管）内，对照组为100 μL 清水， 将装有提取物或清水的EP 管放置于黏虫板中心处。 每次试验将10 头冷昏迷的红铃虫雌虫或雄虫放于玻璃管中央处，每个提取物或对照组均重复试验8 次，共测试雌虫和雄虫各80 头。 试验在黑暗环境中进行， 每日17：00 开始试验，次日08：00 结束。 记录在有寄主植物气味条件下，带有提取物的黏虫板和清水对照黏虫板分别诱捕到的红铃虫数量。

图2 寄主植物对提取物引诱效果影响试验装置示意图Fig. 2 Schematic diagram of the device for the influence of host plants on the attractive effect of extracts

1.3.5提取物与芳樟醇不同比例复配的增效作用。 为了进一步提升引诱效果，选择鳞翅目害虫常见引诱剂芳樟醇与花椒提取物进行复配。 将花椒提取物配制成15 g·L-1的溶液，与芳樟醇原液按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9（体积比，下同）复配得到复配剂，以蜂蜜水为对照组，进行气味选择试验，试验方法同1.3.3。

1.3.6红铃虫对复配剂、提取物和芳樟醇的嗅觉反应试验。 为验证复配剂增效作用，检验复配剂对红铃虫的引诱作用是否高于2 种单剂， 选择1.3.5 筛选出的复配剂分别与花椒提取物和芳樟醇原液2 种单剂进行气味选择试验，分为复配剂与花椒提取物、 复配剂与芳樟醇原液2 类处理。其余方法同1.3.3。

1.4 数据处理

参照周丽梅等[15]方法计算选择反应率（RSR），公式：RSR（%）＝N1/（N1＋N0）×100%。 式中，N1为处理组气味源虫数，N0为对照组气味源虫数。

红铃虫对4 种中药材提取物的EAG 反应相对值，以及花椒提取物与芳樟醇不同比例复配剂的RSR采用单因素方差分析和最小显著差数法进行多重比较。 红铃虫雌雄虫对花椒和云木香提取物的嗅觉反应， 以及复配剂增效作用的验证，均采用卡方检验对处理组与对照组虫数进行分析。所有数据处理利用SPSS 17.0 软件完成。

2 结果与分析

2.1 红铃虫触角EAG 反应

由图3 可知， 当气味源质量浓度为15 g·L-1时， 由花椒提取物引起的雌雄虫触角EAG 反应相对值均最高，分别为1.89 和1.56，显著高于其他提取物引起的雌虫和雄虫触角EAG 反应；云木香提取物引起的雄虫触角EAG 反应相对值极显著高于五倍子提取物。

图3 红铃虫对4 种中草药提取物的触角电位图（EAG）反应相对值Fig. 3 Relative electroantennogram (EAG) values of P. gossypiella antennas to extracts from four Chinese herbal medicines

经方差分析， 当气味源质量浓度降低到1.5 g·L-1时，4 种提取物引起的雌虫 [F（3, 28）＝1.69＜F0.05（3, 28）＝2.95]和雄虫触角[F（3, 28）＝0.97＜F0.05（3, 28）＝2.95）] EAG 反应相对值间均无显著差异。

2.2 红铃虫嗅觉反应

根据2.1 结果，选择EAG 反应相对值较高的花椒和云木香提取物进行嗅觉反应试验。 经卡方检验，相对于对照组，花椒提取物对红铃虫雌雄虫均有极显著的引诱作用（χ2雌虫＝26.92＞χ20.01＝6.64，χ2雄虫＝66.28＞χ20.01＝6.64），120 头供试红铃虫中分别有76 头雌虫和89 头雄虫选择了花椒提取物，选择反应率分别为67.26%和76.72%。云木香提取物对于红铃虫雄虫具有极显著的引诱作用（χ2＝44.37＞χ20.01＝6.64），供试雄虫有84头选择了云木香提取物， 选择反应率为71.19%，但雌虫则对云木香提取物的嗅觉反应不明显（χ2＝0.442＜χ20.05＝3.84）。

2.3 棉花植株对提取物引诱作用的影响

根据2.2 试验结果， 由于云木香对红铃虫雌虫引诱作用不明显，因此本试验设置花椒引诱雌虫、雄虫以及云木香引诱雄虫3 个处理。 在棉花植株气味干扰下，共有38 头雌虫被花椒诱捕，10头雌虫被清水对照诱捕；对于雄虫，有42 头被花椒诱捕，9 头被清水对照诱捕。 经卡方检验，相比于清水对照，花椒提取物具有极显著的引诱作用（χ2雌虫＝32.67 ＞χ20.01＝6.64，χ2雄虫＝42.71 ＞χ20.01＝6.64）。 云木香提取物对雄虫也具有显著的引诱作用（χ2＝25.04＞χ20.01＝6.64），共诱捕了40头， 而清水对照仅诱捕到14 头。 从诱捕数量来看，2 种提取物与棉花叶片引诱效果相当， 因此须筛选具有增效作用的复配剂， 进一步提升提取物引诱效果。

2.4 提取物与芳樟醇不同比例复配的增效作用

经方差分析，花椒提取物与芳樟醇不同配比对雄性[F（8, 45）＝6.783＞F0.05（8, 45）＝2.15]和雌性红铃虫[F（8, 45）＝5.999＞F0.05（8, 45）＝2.15]的选择反应率有显著影响。 如图4 所示，当花椒提取物与芳樟醇体积比为7∶3、6∶4、5∶5 时，雄性红铃虫的选择反应率分别为68.89%、72.22%和70.00%，均显著高于其他复配比例。 对于雌性红铃虫而言， 当花椒提取物与芳樟醇体积比为3∶7 和2∶8 时， 雌性红铃虫的选择反应率高于其他配比， 其中当体积比为3∶7 时最高，为68.55% 。

图4 花椒提取物与芳樟醇按不同比例复配后的引诱作用比较Fig. 4 Attractive effect of Z. bungeanum extract mixed with linalool in different proportions

2.5 红铃虫对复配剂、提取物和芳樟醇的嗅觉选择试验

根据复配增效试验结果，分别选择对雌虫引诱效果最好的和对雄虫引诱效果最好的复配比例，检验其增效作用。 经卡方检验可知，花椒提取物与芳樟醇复配剂（3∶7）对雌虫的引诱效果均显著高于单一的花椒提取物（χ2＝6.353＞χ20.05＝3.84）和芳樟醇（χ2＝4.29＞χ20.05＝3.84）；而花椒提取物与芳樟醇复配剂（6∶4）对雄虫的引诱效果则极显著高于花椒提取物单剂（χ2＝8.96＞χ20.01＝6.64）， 并且显著高于芳樟醇 （χ2＝4.74＞χ20.05＝3.84）。 表明相比于单剂，2 种复配比例均具有显著的增效作用。

3 讨论与结论

筛选对昆虫具有嗅觉反应活性的植物资源是昆虫驱避剂和引诱剂开发的基础[16-18]，其中对一些具有强烈特殊香气的中药材植物的研究已取得一些成果。 目前主要研究了此类植物的驱避活性，例如茆国锋等[19]研究表明白木香（Aquilaria sinensis） 精油在一定质量浓度范围可对褐飞虱（Nilaparvata lugens）雌成虫表现出明显的驱避作用；而花椒精油也被证实对B 型烟粉虱（Bemisia tabaci）具有驱避作用[20]。然而本研究结果表明，云木香和花椒这2 种非寄主中草药提取物对红铃虫具有引诱作用。 前人研究发现，昆虫有时也会被非寄主植物所吸引，如张献英等[21]报道了洋葱（Allium cepa） 鳞茎挥发物对褐飞虱的引诱作用。 Zhang 等[22]则发现暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）在田间会被非寄主植物蓖麻（Ricinus communis）所吸引，且蓖麻气味可提高雌雄成虫的抱对率和飞行活动能力。 因此，在筛选引诱剂时，也不应忽视一些非寄主植物资源。

根据前人研究，我们推测花椒和云木香提取物中的挥发物与红铃虫寄主植物挥发物可能存在一定的相似性。 研究表明花椒果实挥发物中含有大量的柠檬烯和月桂烯[23]，而这些化合物在许多亚洲棉 （Gossypium arboreum） 和陆地棉（G.hirsutum）中均存在，如石远321、SGK321、辽阳多毛棉等，这类化合物还可以引起一些棉铃虫（Helicoverpa armigera）、 绿盲蝽等害虫的电生理反应，具有较强的引诱作用[24]。云木香挥发物中也含有对棉花害虫具有吸引作用的邻苯二甲酸二乙酯[25-26]。 然而，目前有关中草药植物挥发物对红铃虫引诱作用的研究仍相对较少，因此未来应进一步明确云木香和花椒提取物中对红铃虫有引诱作用的具体有效成分，这对于这2 种中草药的开发与利用具有重要意义。

芳樟醇是一种广泛存在于植物挥发物中的化合物，在花椒和棉花挥发物中也存在，并已发现其对多种害虫有引诱活性[24-25,27]。例如刘永梅等[28]研究表明10 μL 的50 g·L-1芳樟醇处理可以引起4 龄飞蝗（Locusta migratoria）强烈的电生理反应，10 μL 的100 g·L-1芳樟醇处理对飞蝗雌雄虫均有显著的引诱作用；此外，李晓峰等[29]则发现将芳樟醇与邻苯二甲酸二丁酯和顺-3- 己烯基乙酸酯制成复配剂对华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）雄成虫有较好的引诱效果。 将多种引诱剂组合成复配剂是提高引诱剂引诱效果的重要手段[16]，复配剂的引诱效果与复配比例有很大关系[28,30]。 因此，本研究将花椒提取物与芳樟醇进行复配，并筛选出了最佳复配比例，在该配比下的嗅觉选择试验中红铃虫对复配剂的选择性均高于花椒提取物和芳樟醇单剂，这表明添加芳樟醇有助于提升花椒提取物的引诱效果。 此外，这种增效作用、最佳复配比例与红铃虫性别有关：复配剂中芳樟醇比例适当升高对雌虫引诱效果增强， 配比为3∶7 时对雌虫的引诱效果最强；而复配剂中花椒提取物比例较高时则对雄虫引诱作用较高， 配比为6∶4 时对雄虫引诱作用最强。 这表明红铃虫雌雄虫之间存在嗅觉反应差异，在寄主选择过程中对寄主挥发物中不同气味的反应各有侧重。 然而目前对于红铃虫嗅觉机理的研究较少，对于该虫寄主定位过程中究竟哪些化合物发挥了作用仍不明确，因此这种复配剂的增效作用原理仍有待研究。

综上所述，本研究通过一系列室内试验初步筛选出了2 种对红铃虫有较高活性的引诱剂配方，对红铃虫的防治具有潜在的应用价值。 近年来中草药植物在农业病虫害防治领域的作用日益受到关注[19,31]，本研究的发现也可为中药材资源利用开发提供依据。 但由于田间环境的复杂性，本研究筛选的引诱剂仍需田间试验进一步检验引诱效果。