人参皂苷Rg1对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞的保护作用及其分子机制

颜倩，石丹宁，杨佳迪，何悦双，赵丕文（北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488）

近年来，由于环境污染及生活、工作压力的日益增加，卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）及其导致的生殖功能障碍发生率明显上升，引起了大家的普遍关注[1]。POF 是指在女性40 岁以前出现卵巢功能衰退的现象，其发病率约1%[2]。临床特征表现为闭经，伴随高促卵泡激素（FSH）和低雌激素水平[3]等。

目前POF 的发病机制尚不完全明确。临床上，对POF 患者常采取的治疗方法是雌激素替代疗法[4]，虽然可明显缓解症状，但由于激素治疗所带来的致癌等不良反应及高复发率等问题，使患者对激素治疗的依从性普遍较低，在临床应用中受到一定限制。因此，寻找具有疗效确凿且不良反应小的抗POF 药物并揭示其分子机制具有重要的理论和临床意义。有研究者发现，人参主要活性成分人参皂苷Rg1能明显改善POF 的症状和体征[5]，但其发挥作用的分子机制尚待阐明。近年来研究发现FSH 受体（FSHR）可介导激活细胞内多条信号通路，如PI3K/AKT 通路，影响生殖细胞的生长发育[6]。PI3K/AKT 通路与POF 发病机制关系密切，通过激活该通路，可显著抑制细胞的增殖与凋亡[7]。此外，本课题组前期研究中已利用顺铂体外诱导卵巢颗粒细胞损伤，成功建立了POF 模型[8]。因此，本研究利用该模型深入探讨人参皂苷Rg1对FSHR/PI3K/AKT 通路的调控作用，揭示人参皂苷Rg1对卵巢颗粒细胞保护作用的可能分子机制，为人参皂苷Rg1应用于POF 临床治疗提供新的理论依据。

1 材料

1.1 动物

健康雌性SD 大鼠16 只，22 ～24 d，体质量为（55±2）g（北京华阜康生物科技股份有限公司），饲养在温度为（25±3）℃，湿度50%～60%，光照12 h，实验前适应性喂养7 d。动物使用许可证：SYXK [京] 2020-0033。

1.2 试药

人参皂苷Rg1（源叶生物，批号：RSZD-121106，纯度≥98%），β-雌二醇（E2，批号：100182-201906，纯度：96.3%，中国食品药品检定研究院），顺铂（源叶生物，批号：B24462）。Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium/Ham’s F-12 50/50 Mix（DMEM/F12）（Cellgro 公司，货号：10-092-CVR），HE 染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），BCA 蛋白定量试剂盒、Hoechst33258 试剂盒（北京索莱宝公司），抗体FSHR、PI3K、p-AKT、AKT、Bcl-2、Bax、β-actin、Coralite594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody（美国Proteintech），LY294002（Abcam，美国ab146593）。

2 方法

2.1 体外原代卵巢颗粒细胞的提取与培养

SD 大鼠适应性喂养结束后，每只注射孕马血清促性腺激素（PMSG）50 IU，48 h 后，无菌环境下提取双侧卵巢颗粒细胞进行培养。操作步骤如下：① 取SD 雌鼠，经颈椎脱臼处死，于75%乙醇中消毒3 min；② 将SD 雌鼠放入消毒托盘中取出双侧卵巢，并加入适量预冷PBS；③将卵巢表面的脂肪，包膜等处理干净后，放入预冷PBS 的消毒托盘中清洗；④ 将卵巢移入无血清培养基中，并用1 mL 一次性注射器刺破卵巢边缘的卵泡，使卵巢颗粒细胞充分释放；⑤ 处理完毕后，将含有卵巢颗粒细胞的无血清培养基移入EP 管，离心（半径 8 cm，1000 r·min-1）10 min；⑥ 弃上清液，加入适量的PBS 冲散细胞，1000 r·min-1离心5 min；⑦ 再次弃上清液，加入一定量的含10% 胎牛血清DMEM/F12 培养基，并吹打均匀；⑧ 调整细胞悬液浓度，以1×105个/孔接种于96 孔板，于37℃、5% CO2培养基中培养，3 d 后换一次培养基。观察细胞贴壁情况，待细胞生长至75%～80%时用于后续实验。

2.2 卵巢颗粒细胞鉴定

2.2.1 HE 染色 将颗粒细胞接种于含爬片的24孔板，培养基体积为1 mL/孔，细胞数量1×106个/孔，按照HE 染色试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：① 移除旧培养基，PBS 洗涤3 次，每次5 min；② 在37 ℃下，用4%多聚甲醛先固定20 min，然后PBS 洗涤3 次，每次5 min；③苏木素染色2 min，自来水冲洗2 min；④ 盐酸乙醇分色2 s，快速取出并用自来水小心冲洗3 min；⑤ 醇溶性伊红染色2 min，自来水冲洗；⑥ 无水乙醇脱水，并用二甲苯透明化处理。封片后镜下观察细胞形态并拍照。

2.2.2 免疫细胞化学法 以 1×106个/孔的密度将颗粒细胞接种于含爬片的24 孔板中，使用免疫细胞化学法测定FSHR 表达量。具体操作如下：① 弃培养基后用PBS 洗涤3 次，每次2 min；②先用4%多聚甲醛于37℃下固定15 min，接着PBS 洗涤3 次，每次3 min；③ 每孔加0.5 mL5%BSA 室温封闭1 h 后弃掉；④ 每孔加0.5 mL FSHR 一抗（1∶250），4 ℃过夜，次日PBS 洗涤3 次，每次10 min；⑤ 每孔加0.5 mL 相对应的羊抗兔二抗（1∶200），室温条件下，避光孵育1 h，PBS 洗涤3 次，每次10 min；⑥ 将含DAPI 的抗荧光淬灭封片剂滴加于载玻片上，盖上爬片，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.3 CCK8 法

2.3.1 实验分组 不同质量浓度人参皂苷Rg1（0 ～ 400 ng·mL-1）处理颗粒细胞24 h，用于研究人参皂苷Rg1对颗粒细胞的毒副作用，并根据结果选择人参皂苷Rg1低、中、高浓度。不同质量浓度顺铂（0 ～80 μg·mL-1）处理颗粒细胞12 h，用于建立POF 模型，并选出最佳造模浓度。然后，将细胞分为正常组、模型组、人参皂苷Rg1低（顺铂+低浓度人参皂苷Rg1）、中（顺铂+中浓度人参皂苷Rg1）、高浓度组（顺铂+高浓度人参皂苷Rg1）和E2 组（顺铂+β-雌二醇），并分别培养24、48 h，用于研究人参皂苷Rg1对顺铂作用下颗粒细胞的影响，并根据实验结果选择最佳人参皂苷Rg1的浓度。

2.3.2 细胞活力检测 以1×105个/孔将颗粒细胞接种于96 孔板，每组5 个复孔，药物处理结束后，将含10% CCK8 无血清DMEM/F12 培养基加入每个孔中，100 μL/孔，并在37℃下继续培养2.5 h，于450 nm 处检测吸光值。

2.4 Hoechst 33258 染色

按“2.3.1”项下方法进行细胞的分组与给药，用4%多聚甲醛固定后加入Hoechst 33258 染色液反应5 min。其他操作同“2.2.2”项下⑤⑥的步骤。

2.5 Western blot

使用预冷PBS 清洗细胞后，用含1% PMSF和1%磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解细胞，提取总蛋白。离心后吸取上清液，进行BCA 蛋白定量。用12% SDS-PAGE 分离蛋白，将蛋白转移到PVDF 膜（100 V 75 min）。然后，室温下封闭1.5 h，再将膜与一抗：FSHR 抗体（1∶1000）、PI3K 抗体（1∶1000）、Akt 抗体（1∶1000）、p-AKT抗体（1∶1000）、Bax 抗体（1∶1000）、Bcl-2 抗体（1∶1000）和β-actin 抗体（1∶5000）在4 ℃孵育过夜。用PBST 洗涤3 次，每次10 min 后，加入对应的二抗（1∶10 000）室温孵育1 h。再用PBST 洗涤3 次，每次10 min，用BCL 发光底物后使用凝胶成像仪显影，通过Image J 软件统计条带灰度值。

2.6 统计学分析

采用SPSS 18.0 软件对数据进行统计学分析，实验结果以均值±标准差表示，组间差异用单因素方差分析检验，两两比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 卵巢颗粒细胞的鉴定

HE 染色结果显示，细胞贴壁生长，体积较大，呈多角梭形，细胞核位于细胞中央，为深蓝色，呈卵圆形或者不规则形；胞质为淡红色，染色均匀，边缘清晰（见图1）。免疫细胞化学法结果显示，卵巢颗粒细胞的特异性标志物FSHR 在胞质中大量表达，呈红色，在核呈深蓝色，结果表明分离到的细胞是卵巢颗粒细胞（见图2）。

图1 卵巢颗粒细胞形态（HE 染色，×200）Fig 1 Morphological of ovarian granulosa cells（HE staining，×200）

图2 免疫荧光检测卵巢颗粒细胞FSHR 的表达（免疫荧光染色，×200）Fig 2 Expression of FSHR in ovarian granulosa cells detected by immunofluorescence（immunofluorescence staining，×200）

3.2 人参皂苷Rg1 对卵巢颗粒细胞增殖的影响

应用0、12.5、25、50、100、200、300、400 ng·mL-1的人参皂苷Rg1作用于颗粒细胞后，细胞存活率分别为100%、100.94%、100.03%、101.28%、99.86%、100.02%、100.74%、101.78%，表明在此质量浓度范围内，人参皂苷Rg1并未对颗粒细胞产生毒性作用（见图3A）。人参皂苷Rg1在100、200、300 ng·mL-1时，细胞的存活率较为稳定。所以本实验选取100、200、300 ng·mL-1分别作为人参皂苷Rg1低、中、高浓度进行后续实验。

3.3 顺铂诱导的POF 模型建立

如图3B 所示，与正常组相比，顺铂作用于颗粒细胞12 h 后，细胞的存活率随着顺铂质量浓度的增加而下降。基于顺铂处理卵巢颗粒细胞的半数抑制浓度（IC50），选取40 μg·mL-1顺铂处理细胞12 h 作为后续POF 模型建立的条件。

3.4 人参皂苷Rg1 对卵巢颗粒细胞的保护作用

如图3C 所示，40 μg·mL-1顺铂处理12 h 后，再使用低浓度、中浓度和高浓度人参皂苷Rg1处理后，其存活率随着人参皂苷Rg1质量浓度的增加显著提高，且高质量浓度对细胞的保护作用最为明显。以上结果表明，人参皂苷Rg1可保护顺铂诱导的细胞损伤，在高质量浓度时作用效果最佳。因此，选取高质量浓度人参皂苷Rg1用于完成后续分子机制的研究。

图3 人参皂苷Rg1 对颗粒细胞增殖的影响Fig 3 Effect of ginsenoside Rg1 on granulosa cell proliferation

3.5 人参皂苷Rg1 对卵巢颗粒细胞凋亡的影响

与正常组相比，模型组胞核呈亮蓝色荧光，并出现固缩与破碎现象；与模型组相比，高质量浓度人参皂苷Rg1组和E2 组胞核荧光强度降低，且核固缩与破碎现象显著减少（见图4）。

图4 人参皂苷Rg1 对顺铂损伤的颗粒细胞凋亡的影响（Hoechst 33258 染色，×200）Fig 4 Effect of ginsenosid Rg1 on the apoptosis of cisplatin-injured granulosa cells（Hoechst 33258 staining，×200）

3.6 Western blot 检测细胞内相关蛋白的变化

与正常组相比，模型组中FSHR、PI3K、p-AKT/AKT 和Bcl-2 蛋白表达均显著减少，Bax 蛋白表达均增加；与模型组相比，人参皂苷Rg1高浓度组和E2 组中FSHR、PI3K、p-AKT/AKT 和Bcl-2 蛋白表达水平均表达增加，Bax 的表达减少（见图5及图6）；与人参皂苷Rg1高浓度组和E2组相比，人参皂苷Rg1高浓度+抑制剂组和E2+抑制剂组中Bcl-2 蛋白表达均明显减少（见图7）。

图5 人参皂苷Rg1 对顺铂损伤的颗粒细胞中Bax 和Bcl-2 表达的影响Fig 5 Effect of ginsenosid Rg1 on Bax and Bcl-2 expression in cisplatin-injured granulosa cells

图6 人参皂苷Rg1 对顺铂损伤的颗粒细胞内FSHR/PI3K/AKT 信号通路关键蛋白表达的影响Fig 6 Effect of ginsenosid Rg1 on the expression of key proteins in FSHR/PI3K/AKT signaling pathway in cisplatin-injured granulosa cells

图7 PI3K 抑制剂对顺铂损伤的颗粒细胞Bcl-2 蛋白表达的影响Fig 7 Effect of PI3K inhibitor on the expression of Bcl-2 protein in cisplatin-injur granulosa cells

4 讨论

POF 是一种由遗传和免疫等原因引起的发生于40 岁以下女性的内分泌紊乱性疾病[9]，伴有多组织、器官功能障碍，如心血管、骨骼系统相关疾病的发生，甚至促使患者提前衰老，影响其寿命[10-11]。临床上激素替代疗法虽能明显改善患者的症状与体征，但也增加了子宫内膜癌、乳腺癌和静脉栓塞性疾病等发生的风险[12]。近年来，研究发现，人参皂苷Rg1可显著提高卵巢组织的抗衰老能力和POF 小鼠的生育能力[13-14]。课题组前期研究也发现，通过激活PI3K/AKT 通路与抑制颗粒细胞凋亡可改善POF，保护卵巢功能[8，15]。因此，本研究从体外提取原代卵巢颗粒细胞，探讨人参皂苷Rg1是否通过调控FSHR/PI3K/AKT 途径发挥抗POF 作用。

顺铂是临床一线常用化疗药物，其对肿瘤细胞具有明确的杀伤作用，但其对正常组织细胞的结构和功能也有损伤，研究表明，顺铂可导致POF[16]。另外，在顺铂诱导的POF 大鼠模型中，血清FSH 显著升高，且其卵巢组织衰退性改变与化疗药应用于人体导致的POF 病变过程很相似[17]。因此，本实验利用顺铂诱导卵巢颗粒细胞损伤来建立POF 模型。

FSH 是哺乳动物生殖与发育的重要激素，可促进卵泡的发育、卵母细胞的成熟和性类固醇激素的合成[18]。POF 患者检查结果主要显示为血清FSH值增高和卵泡发育不成熟，其原因可能是卵巢组织上FSH 受体（FSHR）的功能减弱或受损，导致对FSH 刺激不敏感，从而抑制卵泡的发育[19]。本研究结果显示，人参皂苷Rg1可显著增强细胞中FSHR 表达，即人参皂苷Rg1可通过上调FSHR 的表达，促进对卵巢颗粒细胞的增殖生长。

FSH 与靶细胞表面FSHR 结合后，可激活PI3K/AKT 信号通路[20]，促进生殖系统的发育与成熟。在D-半乳糖诱导的POF 模型中，姜黄素可通过激活PI3K/AKT 信号通路，有效抑制颗粒细胞凋亡和卵巢损伤[21]。在环磷酰胺和白消安诱导的小鼠POF 模型中，胚胎干细胞来源细胞外小囊泡可以通过激活PI3K/AKT 通路，明显提高血清性激素水平，增加卵泡数量和减少凋亡细胞数量[22]。Wang 等[23]研究表明，针刺百会、关元和太冲等可通过上调PI3K/AKT 通路关键蛋白的表达，抑制颗粒细胞凋亡和改善卵泡的发育，从而减轻环磷酰胺诱导的POF。本研究结果显示，人参皂苷Rg1可明显提高PI3K 和p-AKT 的蛋白表达，提示人参皂苷Rg1可通过上调FSHR 蛋白的表达，激活下游PI3K/AKT 途径中关键蛋白的表达。

PI3K/AKT 通路不但是影响POF 的重要途径，还是影响细胞凋亡的重要途径。在卵巢颗粒细胞凋亡过程中，Bcl-2 和Bax 两种调控因子通过形成同/异源二聚体的形式发挥重要作用。Bcl-2和Bax 两者互为拮抗作用，当Bax 蛋白水平表达上调时，Bax 可与Bax 结合形成同源二聚体，促进颗粒细胞的凋亡。反之当Bcl-2 水平上调时，Bcl-2 可与Bax 形成异源二聚体，抑制颗粒细胞凋亡[24-25]。本研究结果显示，人参皂苷Rg1可显著增强Bcl-2 蛋白表达并降低Bax 表达，而加入PI3K 抑制剂后，Bcl-2 蛋白表达显著降低，即人参皂苷Rg1可通过激活FSHR/PI3K/AKT 途径，抑制颗粒细胞凋亡，保护卵巢的功能。

综上所述，人参皂苷Rg1可能通过激活FSHR/PI3K/AKT 信号通路，抑制顺铂损伤的颗粒细胞凋亡，从而保护卵巢颗粒细胞免受损伤。该实验结果或为深入了解中药人参的药理作用机制和Rg1的进一步研究提供参考。