制备纳米粒联合高强度聚焦超声治疗三阴性乳腺癌：体外实验

康正樾，冯潇铃，廖洪建，张志飞，杜永洪

(重庆医科大学生物医学工程学院 超声医学工程国家重点实验室重庆市生物医学工程学重点实验室，重庆 400016)

目前临床对三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)多采用联合治疗[1]。高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound, HIFU)将超声波聚焦于体内病灶靶点区，通过热效应、机械效应和空化效应对病灶进行消融[2]；但长时间HIFU辐照可致机体升温，并存在声通道损伤等安全问题。液态氟碳纳米粒(nanoparticle, NP)可于HIFU辐照下发生液气相变而产生空化核，降低空化效应阈值，增强其生物学效应[3]。本研究制备包载PFH并与AS1411适配体连接的特异性靶向TNBC可降解AS1411/PFH-NP[4]，观察其与HIFU联合治疗TNBC的价值。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备 聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]-PEG50/50-COOH(济南岱罡生物科技有限公司)；CHCl3，异丙醇(重庆市川东有限公司)；聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)，十四氟己烷(perfluorohexane, PFH)，1,1-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiI)，4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)， 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)，N-hydroxysuccinimide(NHS)，琼脂糖(Sigma)；MES(Thermo Fisher Scientific)；核酸适配体AS1411，FAM荧光标记核酸适配体AS1411-FAM[生工生物工程(上海)股份有限公司]。细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8，Dojindo)，XL2020型声振仪(Sonics)，透射电镜(transmission electron microscope，TEM，Hitachi)，马尔文激光粒度仪(Zetasizer)，光学显微镜(Olympus)，激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM，Nikon)，CytoFLEX(Beckman Counter，Inc.)，聚焦超声肿瘤治疗系统(JC200型，重庆海扶医疗科技股份有限公司)，Mylab 90(Esaote)，ImageJ软件(美国国立卫生研究院)，多功能酶标记仪器(ThermoFisher)。

1.2 制备AS1411/PFH-NP 取40 mg PLGA-PEG50/50-COOH完全溶解于2 ml CHCl3溶液作为油相，加入200 ml PFH作为水相，在冰浴中采用声振仪乳化得到初乳，再加入4% PVA溶液4 ml，继续在冰浴中以声振仪乳化形成复乳，之后加入8 ml异丙醇溶液并搅拌、离心、洗涤，冻干后得到PFH/PLGA@NP。采用碳二亚胺法称取20 mg PFH/PLGA@NP完全重悬于5 ml MES中(pH为5.5，0.1 mol/L)，并按PFH/PLGA@ NPs∶EDC∶NHS=1∶2∶2比例加入EDC、NHS，充分活化后重悬于5 ml MES中(pH为8.0，0.1 mol/L)，加入 1 ml AS1411(1 μmol/L)后置于摇床上振荡过夜，经离心(10 000 rpm，10 min)洗涤后得到靶向AS1411/PFH-NP。以双蒸水为水相，采用双乳化法得到空白NP。

1.3 检测物理特性 采用马尔文粒径仪检测AS1411/PFH-NP粒径和Zeta电位，以TEM观察其形态。以上述方法制备DiI荧光标记的AS1411-FAM/PFH-NP后，采用CLSM观察经FAM绿色荧光修饰的核酸适配体AS1411与经DiI红色荧光标记的AS1411/PFH-NP的连接情况，以流式细胞仪定量检测其连接率。将1 ml AS1411/PFH-NP悬液(1 mg/ml)置于1.5 ml EP管，分别置于37、58及80℃水浴中30 s，以光学显微镜观察其相变能力。

1.4 检测细胞毒性 将处于对数生长期的MB-231 TNBC细胞和LO-2人正常肝脏细胞以2×104/孔接种于96孔培养板并孵育24 h(37℃，5% CO2)，去除培养基后，以无血清细胞培养基(100 μl/孔)将消毒的AS1411/PFH-NP配制为不同浓度溶液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/ml)，置于96孔培养板中，各设6个重复孔；孵育24 h后，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤；再向每孔中加入含10% CCK-8试剂的无血清培养基100 μl，孵育 4 h后，以多功能酶标记仪器检测细胞在450 nm波长下的吸光度，即光密度(optical density, OD)，计算各浓度下细胞存活率：细胞存活率=(ODNP-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100%；其中NP表示含细胞、培养基及AS1411/PFH-NP，blank表示含培养基、不含细胞及AS1411/PFH-NP，control表示含细胞及培养基、不含AS1411/PFH-NP。

1.5 检测MB-231 TNBC细胞靶向能力 以1×105/孔将MB-231细胞接种于CLSM培养皿中孵育24 h；按照上述方法分别制备DiI荧光标记的PFH-NP和AS1411/PFH-NP；将所有细胞分为2组：①非靶向组，含DiI荧光标记PFH-NP的培养基(2 mg/ml)；②靶向组，含DiI荧光标记AS1411/PFH-NP的培养基(2 mg/ml)。将2组细胞分别与相应培养基共孵育4 h后，以4%多聚甲醛固定细胞15 min，再以DAPI进行细胞核染色10 min；每个步骤结束后均以PBS洗涤细胞3次。最后在CLSM下观察NP与细胞的结合情况。

1.6 体外超声成像 预先制备3%琼脂糖凝胶体膜，内有1.5 ml 离心管形状的半开放凹槽，用于盛放样品液。将1 ml PBS、1 ml 空白NP(2 mg/ml)及1 ml AS1411/PFH-NP(2 mg/ml)分别置于3%琼脂糖凝胶体模中，即PBS组、NP组及AS1411/PFH-NP组；以HIFU辐照凹槽中心处(距开口20 mm，100 MHz，120 W/cm2，5 s)。于B-Mode和增强超声造影(contrast enhanced ultrasound, CEUS)模式下以MyLab90采集超声图像，以ImageJ软件定量测量CEUS图像中的ROI(HIFU辐照焦点及凹槽内垂直于声束方向的圆形截面，Φ=12.7 mm)的平均灰度值。

1.7 HIFU联合AS1411/PFH-NP消融离体牛肝组织 以真空脱气装置去除3块长方体离体牛肝组织(12 cm×10 cm×8 cm)中的空气，分别针对超声聚焦超声换能器声束方向距牛肝组织表面4 cm处(即消融区)注射200 μl PBS、200 μl 空白NP(2 mg/ml)及200 μl AS1411/PFH-NP(2 mg/ml)后行HIFU辐照，消融点间距>3 cm；采用机载超声诊断仪监测消融区HIFU辐照前、后图像平均灰度值变化。之后沿平行于声束方向切开牛肝组织，以ImageJ软件计算3块牛肝组织的消融体积和超声能效因子(energy efficiency factor, EEF)[5]：消融体积=π/6×消融后凝固性坏死区长度×凝固性坏死区宽度×凝固性坏死区厚度；EEF=ηPt/V，其中η=0.7，为换能器聚焦系数，P为总辐照声功率(W)，t为总辐照时间(s)，V为凝固性坏死体积(mm3)。

1.8 HIFU联合AS1411/PFH-NP杀伤体外MB-231 TNBC细胞 将处于对数生长期的MB-231细胞以1×106/孔接种于6孔板中并孵育24 h并分为HIFU组、AS1411/PFH-NP组、HIFU+AS1411/PFH-NP组及未干预组；清除培养基后，对HIFU组和未干预组均加入不含AS1411/PFH-NP的无血清培养基，对AS1411/PFH-NP组和HIFU+AS1411/PFH-NP组均加入含AS1411/PFH-NP(2 mg/ml)的无血清培养基，共同孵育4 h后以PBS清洗并以0.25%胰酶(不含EDTA)消化3 min，加入PBS制成细胞悬液并转移至1.5 ml离心管中；对HIFU组和HIFU+AS1411/PFH-NP组以HIFU辐照(100 MHz，120 W/cm2，5 s)离心管中心处，对AS1411/PFH-NP组和未干预组不作辐照处理；对各组以1 000 rpm离心5 min、洗涤2次，最终分别将1×106个细胞重悬于PBS(pH为7.2)500 μl中备用。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.9 统计学分析 采用 GraphPad Prism 8.0统计分析软件。以±s表示符合正态分布的计量资料，采用单因素方差分析进行多组间比较，以Dunnett法进行2组间比较，针对差异有统计学意义的数据行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS1411/PFH-NP物理特性 透射电镜下AS1411/PFH-NP呈球形，形态良好、大小均一，分散性较佳(图1A)，粒径为(249.70±4.72)nm，Zeta电位为(-3.46±0.77)mV(图1B、1C)。光镜下观察，37℃条件下AS1411/PFH-NP未见明显相变，58℃及80℃条件下均可见显著相变，且程度随温度升高而增加(图1D～1F)，表明PFH成功包载。

CLSM下，FAM修饰的核酸适配体AS1411呈绿色荧光(图2A)，DiI标记的AS1411/PFH-NP呈红色荧光(图2B)，并见显著荧光重叠(图2C)；流式细胞仪检测显示二者连接良好，连接率58.11%(图2D)。

2.2 AS1411/PFH-NP细胞毒性 共孵育的AS1411/PFH-NP浓度为0.25～2.00 mg/ml时，不同浓度下LO-2人正常肝脏细胞活性无明显差异；浓度升至4.00 mg/ml时， LO-2细胞活性降低(t=2.335，P<0.05，图3A)；与浓度0.25 mg/ml相比，AS1411/PFH-NP浓度为2.00 mg/ml时，TNBC MB-231细胞活性降低(t=2.952，P<0.05，图3B)，故本研究以2.00 mg/ml为AS1411/PFH-NP最适浓度进行后续实验。

2.3 以AS1411/PFH-NP检测MB-231细胞靶向能力CLSM示MB-231细胞核呈蓝色荧光，所制DiI荧光标记PFH-NP和DiI荧光标记AS1411/PFH-NP均呈红色荧光；靶向组见AS1411/PFH-NP显著聚集于细胞核及细胞周围，非靶向组未见明显红色荧光聚集，表明AS1411/PFH-NP对MB-231乳腺癌细胞具有良好靶向能力。见图4。

2.4 体外超声成像 AS1411/PFH-NP组CEUS图像灰度值大于PBS组及NP组(t=17.24、5.60，P均<0.05)。见图5。

2.5 HIFU联合AS1411/PFH-NP消融离体牛肝组织 经HIFU+AS1411/PFH-NP消融后，牛肝组织凝固性坏死区体积大于HIFU+PBS(t=7.99，P<0.01)及HIFU+NP消融(t=4.33，P<0.05)；经HIFU+AS1411/PFH-NP后，消融区EEF显著小于HIFU+PBS(t=5.41，P<0.01)及HIFU+NP消融区(t=4.82，P<0.01)。见表1及图6。

表1 HIFU联合不同方法体外消融离体牛肝组织效果比较(n=3)

2.6 HIFU联合AS1411/PFH-NP杀伤MB-231乳腺癌细胞 流式细胞仪检测结果显示，HIFU+AS1411/PFH-NP组MB-231细胞凋亡率高于其他组(P均<0.05)。见图7及表2。

3 讨论

应用HIFU协同增效剂可提高HIFU消融效率及安全性。传统微泡造影剂成像效果虽佳，但无法透过血管内皮细胞间隙，故不能用于细胞水平成像及治疗，且其热、化学稳定性差，难以实现临床转化。液态氟碳具有化学和生物学惰性等特殊理化性质，且能降低空化效应阈值，加强HIFU对靶区组织的杀伤效果[6]。PLGA生物安全性良好，已用于临床[7]。本研究制备的载PLGA的AS1411/PFH-NP可于HIFU辐照下发生液气相变，增加空化核，提高HIFU消融效率及杀伤肿瘤细胞效果。

使NP具有主动靶向性有助于HIFU增效剂尽可能聚集于乳腺癌靶区、延长NP在肿瘤组织中的滞留时间。本研究以核酸适配体AS1411修饰载PFH的NP，使其可借助AS1411与MB-231细胞连接并被摄取入胞，MB-231细胞活力在与AS1411/PFH-NP结合24 h后下降，考虑主要原因在于TNBC细胞表面过表达核仁素，可特异性识别适配体AS1411，后者对不同肿瘤细胞均有抑制生长作用[8]。

超声观察显示，AS1411/PFH-NP组均可见细小点状中等回声信号，PBS组及NP组均见弱回声，且AS1411/PFH-NP组CEUS图像灰度值显著大于PBS组及NP组，表明AS1411/PFH-NP具有良好超声显影能力，有助于监控HIFU消融；这是由于AS1411/PFH-NP直径较大，具有液态氟碳内核的空腔结构，可于超声作用下产生背向反射[9]。

本研究以离体牛肝组织作为实验对象检测AS1411/PFH-NP联合HIFU消融效果，发现经HIFU+AS1411/PFH-NP消融后，牛肝组织凝固性坏死体积显著大于HIFU+PBS及HIFU+NP消融后，而HIFU+AS1411/PFH-NP消融区EEF显著低于HIFU+PBS及HIFU+NP消融区，表明AS1411/PFH-NP联合HIFU可提高消融能力；分析原因，主要在于HIFU辐照使PFH发生液气相变，改变了局部声学环境，导致能量沉积增加[10]，且外来空化核亦可增强HIFU生物学效应。HIFU联合AS1411/PFH-NP亦能协同杀伤体外MB-231细胞、促进肿瘤细胞凋亡，可能由于AS1411/PFH-NP增强HIFU空化效应、热效应及机械效应，且伴随空化效应产生的高速微射流及剪切力亦对杀灭肿瘤细胞具有一定作用[11]。

综上所述，本研究制备的特异性靶向TNBC AS1411/PFH-NP可提高体外HIFU消融效率。