p16和HPV DNA检测在ASC-US分流中的价值研究

游伟强 王莉平 吴小延 叶才果 方小龙 林立鹏

1 深圳市福田区妇幼保健院检验科(深圳 518016) 2 中山大学肿瘤防治中心分子诊断科(广州 510060) 3 广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室(东莞 523808)

宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤中对女性造成巨大危害的恶性肿瘤，全球约有50万病例，其中大约四分之三的新近病例发生于医疗资源缺乏的国家[1]。在宫颈细胞学诊断的异常结果中，不能明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)占据了一半以上，数量十分巨大[2- 3]。Srivastava AN等[4]研究了1 473例液基薄层细胞学(thinprep cytology test，TCT)最初诊断和质量控制回顾性复习诊断的符合率仅为42.97%，ASC-US在不同观察者之间诊断的重复性差，误诊和漏诊的可能性较大，但是其对应的宫颈活检结果可以从宫颈炎到宫颈癌，这给临床医师的治疗带来较多的困惑。Gothwal M等[5]和曹洁琼等[6]研究发现，宫颈细胞学p16蛋白检测被认为在ASC-US分流中具有较高的潜力，但是其敏感性较差，以致于漏诊现象常有发生。Wang M等[7]和刘晓旭等[8]研究报道，使用高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)DNA检测对ASC-US进行分流的灵敏度高于TCT检测，但是其特异度差，假阳性率偏高。鉴于ASC-US分流的临床价值高，但目前针对ASC-US的分流尚未提出有效策略，为解决此难题，本研究团队组织开展了此研究。

1 资料和方法

1.1 标本来源

收集2017年3月—2022年1月，585例TCT诊断结果为ASC-US患者的宫颈细胞学标本，使用免疫细胞化学法行p16蛋白检测，生物芯片法行HPV DNA基因分型检测。p16蛋白检测和HPV DNA基因分型检测中只要有一项检测结果为阳性则为联合检测的阳性结果。患者年龄23.26～78.95岁，平均(39.65±12.91)岁。患者采集标本前3天无同房，采集时间为月经干净后3～7天。患者于8周内行阴道镜下病理活检术。研究方案经本单位伦理委员会审批通过(伦理批件号：B2016- 069- 11)。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂及仪器 p16抗体检测试剂盒、巴氏染色试剂盒、PathCIN IHC-Autocyto-Ⅲ全自动TCT制片机和PathCIN IHC-SY7300全自动免疫细胞化学染色仪由深圳市森盈生物科技有限公司生产。人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(生物芯片法)和BHF-V1核酸芯片检测仪由北京博晖创新生物技术集团股份有限公司生产。

1.2.2 宫颈细胞学、宫颈活检标本的制作及诊断依据：采集人体子宫颈口脱落细胞，使用全自动制片机制作TCT薄片，细胞学诊断结果参考TBS- 2014分类标准[9]。SLC- 3000电子阴道镜数字成像系统下取患者宫颈组织，组织学诊断检材的制备技术流程参与临床技术操作规模[10]执行，主要包括：甲醛固定、酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片及苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色等步骤。HE染色具体步骤为：二甲苯5 min共2次，100%酒精2 min共2次，95%酒精2 min共2次，80%酒精1 min，蒸馏水1 min，苏木精染色5 min，蒸馏水1 min，1%盐酸酒精2 s，蒸馏水2 s，1%氨水5 s，蒸馏水1 min，0.5%伊红染色2 min，蒸馏水2 s，80%酒精2 s，95%酒精2 min共2次，100%酒精2 min共2次，二甲苯3 min共3次，中性树胶封固。组织学诊断结果参考世界卫生组织发布的第5版分类标准[11]。本研究以高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)以上病变，含HSIL和宫颈癌，作为疾病研究的终点。

1.2.3 宫颈细胞学的巴氏染色、p16抗体免疫细胞化学染色流程与结果判读：①宫颈细胞学巴氏染色流程：TCT片入95%酒精15 min，苏木精染色10 min，盐酸酒精分化5 s，氨水返蓝5 s，70%酒精1 min，80%酒精1 min，95%酒精1 min，橘黄G4 5 min，95%酒精2 min，EA505 min，95%酒精2 min，100%酒精2 min，二甲苯透明2 min，中性树胶封片。染色结果判读[12]：细胞核深蓝色，鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色。②p16抗体免疫细胞化学染色流程：把制作好的TCT片放在SY7300免疫组化染色机上，按仪器及试剂使用说明书要求，完成宫颈细胞学p16抗体免疫细胞化学染色。染色结果判读[13]，p16阴性：细胞核或胞质无色或不显色。p16阳性：细胞核/胞质染成棕黄色。

1.2.4 HPV DNA基因分型检测流程与结果判读：①检测流程：妇产科医师使用颈刷采集患者适量的宫颈上皮细胞样本，实验室人员充分洗脱宫颈刷，并将洗脱液以3 000 r/min离心10 min，弃上清液，混匀，取200 μL放入加样孔，完成核酸提取、PCR扩赠、杂交和分析等实验步骤。实验设立阳性和阴性对照。②结果判读：1)阳性结果判定：杂交膜的SP点(3个)均有阳性斑点，内参质控点(3个)的GB- 50点有阳性斑点，且有HPV探针阳性斑点出现，为该探针对应亚型阳性；2)阴性结果判定：杂交膜的SP点(3个)均有阳性斑点，内参质控点(3个)的GB- 50点有阳性斑点，且无HPV探针阳性斑点出现，为该探针对应亚型阴性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计数资料，以(%)表示，采用χ2检验比较率的总体差异。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 宫颈细胞学巴氏染色、p16蛋白免疫细胞化学染色结果

ASC-US细胞具有鳞状分化、核质比增高和胞核改变的三个基本特征，见图1A。宫颈脱落细胞胞核/胞质不显色(p16阴性)，见图1B。宫颈脱落细胞胞核染成棕黄色(p16阳性)，见图1C。

图1 宫颈细胞学巴氏染色、p16蛋白免疫细胞化学染色图片(×400)注：A：宫颈细胞学的ASC-US诊断图片(巴氏染色法)；B：ASC-US的p16蛋白阴性表达图片(免疫细胞化学法)；C：ASC-US的p16蛋白阳性表达图片(免疫细胞化学法)

2.2 宫颈细胞 ASC-US对应的组织学诊断结果

585例ASC-US 患者的宫颈活检结果种类丰富，包括：慢性宫颈炎组302例(51.62%)、低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)组176例(30.09%)，HSIL组98例(16.75%)、宫颈癌组9例(1.54%)。4组不同的宫颈活检结果反映了宫颈上皮细胞从宫颈炎-上皮内病变-宫颈癌等不同病理变化过程。见图2。

图2 宫颈细胞 ASC-US对应的组织学诊断图片(×400)注：A：组织学诊断为慢性宫颈炎的图片(HE染色法)；B：组织学诊断为LSIL的图片(HE染色法)；C：组织学诊断为HSIL的图片(HE染色法)；D：组织学诊断为宫颈癌的图片(HE染色法)

2.3 三种不同检测方法在不同级别宫颈病变中阳性率的比较

三种不同检测方法在慢性宫颈炎组(χ2=16.00，P<0.001)、LSIL组(χ2=15.65，P<0.001)、HSIL组(χ2=62.72，P<0.001)中的阳性率总体差异具有统计学意义。在慢性宫颈炎组中，p16免疫细胞化学与HPV DNA基因分型检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。p16免疫细胞化学与(p16+HPV DNA)联合检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。在LSIL组中，p16免疫细胞化学与HPV DNA基因分型检测法差异具有统计学意义(P=0.001)。p16免疫细胞化学与(p16+HPV DNA)联合检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。在HSIL组中，p16免疫细胞化学与HPV DNA基因分型检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。p16免疫细胞化学与(p16+HPV DNA)联合检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。

p16免疫细胞化学检测法(趋势χ2=70.46，P<0.001)、HPV DNA基因分型检测法(趋势χ2=109.31，P<0.001)、(p16+HPV DNA)联合检测法(趋势χ2=151.70，P<0.001)在慢性宫颈炎组、LSIL组、HSIL组、宫颈癌组中的阳性率有递增趋势。使用p16免疫细胞化学检测法，慢性宫颈炎组与LSIL组差异具有统计学意义(P<0.001)、慢性宫颈炎组与HSIL组差异具有统计学意义(P<0.001)、慢性宫颈炎组与宫颈癌组差异具有统计学意义(P<0.001)、LSIL组与HSIL组差异具有统计学意义(P=0.001)、LSIL组与宫颈癌组差异具有统计学意义(P=0.001)、HSIL组与宫颈癌组差异无统计学意义(P=0.044)。使用HPV DNA基因分型检测法，慢性宫颈炎组与LSIL组差异具有统计学意义(P<0.001)、慢性宫颈炎组与HSIL组差异具有统计学意义(P<0.001)、慢性宫颈炎组与宫颈癌组差异具有统计学意义(P<0.001)、LSIL组与HSIL组差异具有统计学意义(P<0.001)、LSIL组与宫颈癌组差异具有统计学意义(P=0.005)。使用(p16+HPV DNA)联合检测法，慢性宫颈炎组与LSIL组差异具有统计学意义(P<0.001)、慢性宫颈炎组与HSIL组差异具有统计学意义(P<0.001)、慢性宫颈炎组与宫颈癌组差异具有统计学意义(P<0.001)、LSIL组与HSIL组差异具有统计学意义(P<0.001)、LSIL组与宫颈癌组差异具有统计学意义(P=0.006)。见表1。

表1 3种不同检测方法在不同级别宫颈病变中阳性率的比较

2.4 三种检测方法对HSIL以上病变诊断效能的比较

三种检测方法诊断HSIL以上病变灵敏度的总体差异具有统计学意义(χ2=63.61，P<0.001)。p16免疫细胞化学检测法与HPV DNA基因分型检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。p16免疫细胞化学检测法与(p16+HPV DNA)联合检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。HPV DNA基因分型检测法与(p16+HPV DNA)联合检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。

三种检测方法诊断HSIL以上病变特异度的总体差异具有统计学意义(χ2=29.94，P<0.001)。p16免疫细胞化学检测法与HPV DNA基因分型检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。p16免疫细胞化学检测法与(p16+HPV DNA)联合检测法差异具有统计学意义(P<0.001)。HPV DNA基因分型检测法与(p16+HPV DNA)联合检测法差异无统计学意义(P=0.841)。

三种检测方法诊断HSIL以上病变符合率的总体差异无统计学意义(χ2=5.54，P=0.063)。(p16+HPV DNA)联合检测方法诊断HSIL以上病变的约登指数值最大。见表2。

表2 不同方法对HSIL以上病变诊断效能比较

3 讨 论

宫颈癌目前仍然是我国的女性肿瘤死亡的主要原因之一，且有年轻化的趋势，与较富裕的北美和欧洲国家相比，其发生率和死亡率仍存在较大的差异[14]。Abdulaziz等[15]对500多个宫颈癌筛查实验室进行调研后发现，宫颈细胞学筛查的异常结果中，ASC-US是最常见的类型。ASC-US报告率介于5%～10%之间。ASC-US的细胞学诊断结果仿佛就是一把双刃剑。一方面，虽然其诊断的重复性很差，但是ASC-US的判读标准较低，最大程度识别了宫颈异常细胞，有助于早期甄别潜在癌前病变或者早期浸润癌。另一方面，据Kuroki等[16]研究报道，最终有4.3%～25%的ASC-US患者可能发展成宫颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ及以上病变，ASC-US的诊断结果可能会引起患者的恐慌。因此，探索一种灵敏度好、特异性高的ASC-US分流方法的临床价值是非常高的。

宫颈细胞学ASC-US病例，组织学诊断结果囊括了宫颈病变从良性到恶性的一个发生、发展的连续变化过程。通过宫颈细胞学ASC-US的筛查，发现HSIL的风险虽不高，但确实是存在的，本研究发现的组织学诊断结果在HSIL以上病变的比例为18.29%，与陈飞等[17]报道的200例ASC-US患者的宫颈活检结果中CINⅡ以上病变为36例，比例为18%，结果基本一致。本研究对象为585例ASC-US患者的宫颈活检结果，数据量更大，统计学结果更为真实，研究结论更严谨。与上一版使用的三级分类(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ)相比，本研究采用最新的第5版二级分类(LSIL和HSIL)与生物学行为的相关性更好，组织学诊断的重复性更佳，研究结果可能更具合理性和科学性。

p16是一种重要的抑癌蛋白，在高危型HPV感染的肿瘤中高表达。高危型HPV感染被认为是引起宫颈癌的病因。本研究从两个不同的视角比较了p16免疫细胞化学、HPV DNA基因分型、(p16+HPV DNA)联合检测法在不同级别宫颈病变中阳性率。第一个视角，探讨了三种不同检测方法在同一级别宫颈病变中阳性率的差异，表1的实验数据证实，(p16+HPV DNA)联合检测在同一级别宫颈病变中阳性率均高于p16免疫细胞化学、HPV DNA基因分型检测，这表明联合检测提高了同一级别的宫颈病变的检出率。蔡春芳等[18]研究报道，ASC-US患者的p16蛋白阳性率为24.08%(46/191),与本研究报道的p16蛋白阳性率29.06%(170/585)非常接近；刘晓旭等[19]研究报道，ASC-US患者的HPV DNA阳性率为50.5%(186/368),与本研究报道的阳性率45.81%(268/585)也非常接近。之所以出现这种比例上的细微差别，很可能是因为研究的标本量不同造成的。第二个视角，比较了同一检测方法在慢性宫颈炎组、LSIL组、HSIL组和宫颈癌组中阳性率的差异，表1的实验数据显示，p16免疫细胞化学、HPV DNA基因分型、(p16+HPV DNA)联合检测的阳性率随着宫颈病变程度的加重而递增。说明p16免疫细胞化学、HPV DNA基因分型单独和联合检测与宫颈病变程度是具有正向线性相关的。这与Song F等[20]研究结论一致。

本研究比较了p16免疫细胞化学、HPV DNA基因分型、(p16+HPV DNA)联合检测对HSIL以上病变诊断效能，表2的实验数据显示，(p16+HPV DNA)联合检测的灵敏度最大，较单独检测而言，能更大程度识别癌前病变和早期癌。尽管联合检测的特异度有所下降，但是表2中的约登指数这一能反映灵敏度和特异度的综合表现能力的指标证实，联合检测的约登指数是最佳的，与此同时符合率也较高。因此，(p16+HPV DNA)联合检测对ASC-US分流价值较好，建议临床推广使用。