2020 年我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征分子流行病学调查

梁俊超，赵 翔，刘红祥，袁 飞，李 坤，郝尧光，王宗升，王辉之，刘 东，杜元钊

（1.吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所，人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林长春 130062；2.青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266000；3.青岛市市北区疾病预防控制中心，山东青岛 266000）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可引发猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称“蓝耳病”。PRRS 是一种高度接触性传染病，导致猪群出现繁殖障碍、免疫抑制及呼吸道疾病等问题，引发猪只死淘率增高，对猪场生产造成严重影响。PRRSV 是一种有囊膜的单股正链RNA 病毒，基因组大小15 kb 左右，含开放阅读框（open reading frame，ORF）至少11 个，编码结构蛋白8 种，非结构蛋白至少16 种。

PRRSV 可分为两大亚群，分别为PRRSV1（欧洲株）和PRRSV2（美洲株）[1]。据ORF5 基因序列分析，PRRSV2 可分为9 个谱系，其中在我国流行的主要分布在4 个谱系，分别为谱系1（代表毒株为NADC30 及MN184B）、谱系3（代表毒株为GM2）、谱系5（代表毒株为VR2332）及谱系8（代表毒株为CH-1a、BJ0706 及JXA1）[2]。2012年前，在我国流行的PRRSV 毒株为经典美洲株（代表毒株CH-1a）和高致病性毒株（HP-PRRSV，代表毒株JXA1），其中2006 年以后HP-PRRSV 为主要流行毒株，其致病力比经典PRRSV 明显增强[3-4]。2012 年NADC30-like PRRSV 被报道。该类毒株易重组，彼此间同源性低，且临床致病性具有明显差异。2017 年后，我国多省发现NADC34-like PRRSV[5-6]。当前，我国主要流行毒株已逐渐 由HP-PRRSV 转 为NADC30-like PRRSV[7]。NADC30-like PRRSV 毒株与美国1-7-4 分支毒株相似，而1-7-4 分支毒株已对美国及秘鲁的养猪业造成重大影响。2020 年美国报道一种美洲型HPPRRSV 毒株，被命名为ORF5 1-4-4 Lineage 1C 变异株（简写为PRRSV 1-4-4）[8]。该毒株传播力强，致死率高，已严重影响美国养猪业。NADC30-like PRRSV、NADC34-like PRRSV 及PRRSV 1-4-4 均为PRRSV2（美洲株），且属于谱系1[9]。

本试验收集2020 年我国部分地区PRRSV 感染临床可疑样品，通过ORF5 基因测序比对分析，了解国内PRRS 的分子流行病学变化情况，旨为PRRS 防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料收集处理

2020 年从山东、河北、江苏、安徽等7 个省，采集570 份疑似PRRSV 感染的病料（胎衣和组织）、血液（全血和脐带血）及精液，经实验室处理后，按照文献[10]的RT-PCR 方法进行抗原检测。

检测用ORF5 基因引物如下：

上 游：CATTTCATGACACCTGAGACCA；下游：AGAGCATATATCATCACTGGCG。

RT-PCR 扩增条件如下：

94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，54 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，32 个循环；68 ℃延伸10 min。

1.2 主要试剂

RNA 提取试剂盒，购于TAKARA 公司；高保真反转录试剂盒，购于罗氏公司；LATaqDNA聚合酶，购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 PRRSV GP5 测序

将PRRSV RT-PCR 阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.4 核苷酸进化分析

通过软件DNAstar Lasergene，对送检测序PRRSV ORF5 基因进行序列同源性比对分析；利用MEGA 6.0 软件，对ORF5 基因序列进行遗传进化分析。

1.5 氨基酸进化分析

通过软件DNAstar Lasergene，对送检测序PRRSV GP5 蛋白氨基酸位点进行分析，并基于ORF5 基因编码序列，通过NetNGlyc l.0 Sever 在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/），预测并分析相应氨基酸序列的糖基化位点。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR 检测

将2020 年采集的570 份疑似PRRSV 感染病料进行RT-PCR 检测，目的条带大小为603 bp。结果（图1、表1）显示：从送检的疑似PRRSV 感染病料中检出PRRSV 病原阳性135 份，阳性检出率为23.68%，其中保育猪病料的阳性检出率最高，为32.24%，哺乳猪次之，为19.09%。

表1 2020 年不同猪群送检病料的PRRSV 阳性检出结果统计

2.2 ORF5 基因同源性比对分析

随机送检60 份PRRSV 阳性样品的PCR 产物进行ORF5 基因测序，经比对后确认得到60个603 bp 的ORF5基因序列。将 这60 个ORF5基因序列按照“送检年月-样品编号-送检省份缩写”进行编号。基因序列对应省份及数量分布见表2。60 个ORF5 基因序列与不同谱系标准毒株序列通过DNAstar 软件的比对结果（表3、图2）显示，60 个ORF5 基因序列彼此间同源性为79.9%～100%，与国内流行的PRRSV2 4 个谱系标准毒株同源性为81.3～99.7%，与PRRSV1 标准毒株同源性仅为60.7%～63.8%，表明这60 个PRRSV毒株均为PRRSV2。

表2 60 个PRRSV 基因序列区域分布及数量 单位：个

表3 60 个PRRSV ORF5 基因序列与标准毒株同源性对比结果 %

2.3 ORF5 基因遗传进化分析

60 个PRRSV 的ORF5 基因序列通过MEGA 6.0 软件绘制遗传进化树。结果（图3）显示，31个PRRSV 属于谱系1，占比达51.67%，26 个属于谱系8，占比达43.33%。此外，1 个PRRSV 属于谱系3，1 个属于谱系5，而剩余1 个（20200624-262-JS）介于谱系5 和谱系8（可能为疑似PRRSV重组毒株，有待进一步研究），占比均为1.67%。

2.4 GP5 蛋白氨基酸位点变异分析

将60 个PRRSV GP5 蛋白氨基酸序列通过DNAstar 软件与相应谱系的标准毒株进行比对。结果（图4）显示，60 个PRRSV GP5 蛋白氨基酸以点突变为主，其中10 个PRRSV 分别在33 aa 或34 aa 处存在缺失突变；信号肽区域（1～25 aa）以及27～39、57～61、120～125、167～170 及189～196 aa等6 个区域的氨基酸点突变集中程度较高。

60个PRRSV GP5蛋白的2个非中和表位（27～30和180～197 aa）、1 个中和表位（37～45 aa）及2 个潜在毒力位点（R13和R151）氨基酸变化及相应谱系占比详见表4。从表4 可知：60 个PRRSV 在非中和表位（180～197 aa）突变比例最高，平均为96.67%；其次为R13潜在毒力位点，突变比例平均为53.33%；非中和表位（27～30 aa）突变比例最低，平均为35.00%；而中和表位及R151潜在毒力位点也发生不同程度突变，平均分别为51.67%和48.33%。

表4 60 个PRRSV 的GP5 蛋白重要氨基酸位点变化及相应谱系占比 %

2.5 GP5 蛋白潜在N-糖基化位点变异分析

通过NetNGlyc l.0 Sever 在线软件，对60 个PRRSV GP5 蛋白氨基酸序列的N-糖基化位点进行预测分析。结果（表5）显示，谱系1 参考毒株NADC30、PRRSV 1-4-4 和NADC34 潜在糖基化位点数量分别为3、4 和5 个，而潜在糖基化位点数量为4 个的样品占比最高，为48.39%（15/31）；谱系3、谱系5 参考毒株与其相应样品PRRSV 潜在糖基化位点数量一致；20200624-262-JS 潜在糖基化位点数量为3 个；谱系8 参考毒株CH-1a和JXA1 潜在糖基化位点数量分别为3 和4 个，潜在糖基化位点数量为4 个的样品占比最高，为73.08%（19/26）。60 个PRRSV 的潜在N-糖基化位点位置主要集中在34～35、43～44 和50～51 aa，占比分别为65.00%（39/60）、96.67%（58/60）和100%（60/60）。

表5 60 个PRRSV 的GP5 蛋白潜在N-糖基化位点数量及位置分布 单位：个

3 讨论

PRRS 是猪场防控的重要猪病。我国猪群PRRSV 感染较普遍，田间流行毒株复杂多样[11]。从PRRSV 的RT-PCR 抗原检测结果可知，疑似发病场的PRRSV 阳性检出率为23.68%，其中保育猪群最高（32.24%），这与猪场临床发病情况相符，主要与保育阶段猪只免疫力低、应激因素多以及环境因素等直接相关[12]。

通过60 个PRRSV 的ORF5 基因同源性比对结果可知，不同PRRSV 毒株间同源性差异较大，谱系1 中PRRSV 与NADC30、NADC34及PRRSV 1-4-4 的同源性为87.1%～97.7%，与其他谱系参考毒株同源性＜88.2%；谱系8 中PRRSV 与JXA1、HuN4 及TJ PRRSV 的同源性为97.2%～99.7%，与其他谱系参考毒株同源性＜89.1%。由此可知，不同谱系PRRSV 的ORF5 基因同源性较低，而PRRSV 同源性高低对PRRSV疫苗保护效果产生影响[13]。

通过进化树结果分析发现：59 个PRRSV分别属于谱系1、谱系3、谱系5 和谱系8，剩余1 个介于谱系5 与谱系8；谱系1 占比最高，为51.67%，其中30 个为NADC30-like PRRSV，仅1 个河北样品为NADC34-like PRRSV，未发现PRRSV 1-4-4 及MN184B PRRSV。结果表明，国内流行的PRRSV 毒株复杂多样，但以NADC30-like PRRSV 为主流流行毒株。该结果与张洪亮等[5]、杨汉春等[14]的报道相符。

N 端胞外域27～41 aa 区域和C 末端180～197 aa 区域是PRRSV GP5 蛋白2 个重要抗原表位相关区域[15]。相关研究[16]显示，GP5 蛋白的C端抗原表位在维持其蛋白构象方面具有重要作用。GP5 蛋白具有3 个重要抗原表位，分别为中和抗原表位37～45 aa、非中和抗原表位（又称诱饵表位）27～30 aa 和非中和抗原表位180～197 aa。非中和抗原表位27～30 aa 和中和抗原表位37～45 aa 在中和抗体产生过程具有关键作用，其中38 和42～44 aa是病毒中和表位的识别位点，39～41 aa 是病毒中和表位的结合位点[17]。通过氨基酸比对结果分析发现，谱系1 中PRRSV 的中和表位及2 个非中和表位均有突变，其中中和表位突变率低，为9.68%，2 个非中和表位27～30 和180～197 aa 突变比例相比中和表位更高，180～197 aa 表位突变比例高达96.77%，这可能对中和抗体产生及GP5 蛋白构象产生影响，导致PRRSV 免疫失败[18-19]。

谱系3 中PRRSV 的3 个表位均发生突变；谱系5 中PRRSV 及20200624-262-JS 各有2 个 表位发生突变，其中180～197 aa 表位均发生突变；谱系8 中的PRRSV 只有中和表位及非中和表位180～197 aa 发生突变，且突变比例均为100%，其中中和表位突变位点主要为39 aa，而该位点是病毒中和表位的结合位点，这或对GP5 蛋白构象及中和抗体对病毒的结合能力产生影响，也可能对蛋白免疫原性产生影响，更利于病毒免疫逃避，影响现有疫苗免疫保护效果[20]。

据相关研究[21]，GP5 蛋白R13和R151与PRRSV 毒力相关，是潜在毒力位点。60 个PRRSV仅20200624-262-JS 的2 个位点均未发生突变，其余59 个PRRSV 均发生不同程度突变，尤其谱系1中PRRSV 的R13位点突变比例高达96.77%，这对NADC30-like PRRSV 的毒力影响程度有待进一步研究。GP5 蛋白具有多个糖基化位点，这些糖基化位点严重影响病毒蛋白的正确折叠及生物学特性，可形成糖基屏蔽效应有利于病毒免疫逃避及持续性感染[21-22]。

通过N-糖基化位点预测发现，60 个PRRSV糖基化位点数量及分布相比各自谱系参考毒株均存在不同程度差异，这也表明不同PRRSV 免疫逃避能力存在差异，因而加重了PRRS 防控的复杂程度。

疫苗免疫是PRRS 防控的重要手段。我国目前商品化的PRRSV 疫苗均为PRRSV2 且属于谱系8，与当下田间流行的NADC30-like PRRSV 野毒株同源性较低。PRRSV 弱毒活苗对不同野毒株具有交叉保护性，其与野毒株同源性高低可能与保护率无关。Opriessnig 等[23]在猪群免疫PRRSV弱毒活苗后，用与疫苗毒同源性仅为76%的高毒力PRRSV 攻毒，发现免疫组比未免疫组肺脏损伤率低37.8%，仅为4.2%。据报道[24]，TJM-F92 等PRRSV 弱毒活苗与NADC-like PRRSV 同源性虽大多小于89%，但对NADC-like PRRSV 仍可提供有效临床保护，减轻临床症状，缩短发病时间，改善平均日增重。由此可知，PRRSV 弱毒活疫苗对同源性低的野毒株也可提供一定的交叉保护，对免疫猪群可提供有效的临床保护，改善猪群体况。总之，PRRS 需要综合防控，猪场除可选用安全有效的PRRSV 弱毒活疫苗外，猪场生物安全及饲养管理也具有重要作用。