2020—2021 年我国部分省份禽呼肠孤病毒分子流行病学调查

李 彬，韩晓青，刘 平，刘红祥，宋姗姗，于 静，范庆增，张宇龙，谭 鹏，杜元钊，刘 东

（青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266032）

禽呼肠孤病毒（avian reoviruses，ARV）属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，基因组为双股分节段 RNA。根据 SDS-PAGE 电泳迁移率不同，可将ARV 的RNA 分为10 个节段，依次为L（L1、L2、L3）、M（M1、M2、M3） 和S（S1、S2、S3、S4）。S1基因编码σC、P10、P17 3 种蛋白，其中P10 和P17 是非结构蛋白，σC 是外壳蛋白。σC 蛋白参与细胞吸附，可诱发机体产生特异性中和抗体，是ARV 的主要抗原决定簇，其变异可导致病毒致病性变化，在ARV 感染及致病中发挥重要作用。ARV 可影响各种禽类，包括鸡、鸭和鹅，肉鸡感染后表现腱鞘炎、心肌炎、免疫抑制和发育迟缓综合症等临床症状，对养禽业造成巨大经济损失[1-3]。

近年来，我国ARV 引起的白羽肉鸡发病率明显升高[4]，发病日龄大多在15 日龄以后直至出栏，发病率为5%～20%。发病鸡群的上一代种鸡群大多免疫过经典ARV 疫苗[5]，说明这种常规疫苗并没有提供足够的临床保护。ARV 易变异重组，因此全面了解其分子流行病学特征具有十分重要的意义。为了解我国鸡群中ARV 的遗传变异特点，2020—2021 年从山东、河北、辽宁、江苏、福建等省份收集疑似ARV 感染样品，采用RT-PCR 方法筛选阳性样本，然后对阳性样本进行σC基因（1 088 bp）测序，并根据测序结果分析ARV 不同基因型的分布规律，以期为我国ARV 感染的防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 样品及来源

2020—2021 年从山东、河北、福建、安徽、辽宁、江苏等6 个省，采集疑似感染ARV 白羽肉鸡的腿或肌腱等组织样本共253 份。采样鸡群涵盖网养、地面平养、笼养等多种饲养方式（表1）。疑似ARV 感染发病鸡群日龄多为15～25 日龄，个别为10 日龄左右；采食、饮水正常，表现趴卧、不愿走动等症状（图1），随病程发展病鸡撇腿明显，多为单侧腿外撇；前期无死亡，后期因瘫痪被踩踏或继发细菌性疾病，导致死淘率增加，至出栏时累计淘汰率为3%～20%。解剖可见，跗关节发青，肌腱水肿、炎性渗出、出血（图2）。

表1 部分样品来源鸡群的流行病学信息

1.2 试剂与耗材

RT-PCR 试剂（一步法试剂盒）和Marker，为Takara 公司产品；50×TAE buffer，为上海生工公司产品；Goldview 核酸染料，为labest 公司产品；琼脂糖，为康为世纪公司产品；核酸提取纯化试剂盒，为杭州博日公司产品。

1.3 仪器与设备

超净工作台DL-CJ-INDII，北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；离心机TD24-WS，eppendorf公司产品；核酸提取纯化仪NPA-32P，杭州博日科技有限公司产品；电泳仪DYY-6C，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像仪JS-2000，上海培清科技有限公司产品；移液器，eppendorf 公司产品。

1.4 方法

1.4.1 病料RNA 提取 取腿或肌腱等组织病料约2 g，加入4～5 mL 灭菌PBS 或者生理盐水，置研磨器（灭菌）中研磨或者用剪刀细心剪碎，置-20 ℃中反复冻融3 次，离心取上清备用。取上述病料样品上清约300 μL 置1.5 mL 的离心管，取样加入自动核酸提取板中，按照说明书操作提取RNA。

1.4.2 RT-PCR 检测 根据NCBI 上发表的ARVσC基因序列设计特异性引物（表2）用于样品检测。引物由上海生工生物工程有限公司合成。RTPCR 反应条件（一步法试剂盒）：50 ℃逆转录30 min，95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共32 个循环；72 ℃延伸5 min。RT-PCR 扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪观察和记录结果。

表2 引物序列和扩增目的片段大小

1.4.3σC基因测序及遗传进化分析 将RT-PCR产物进行电泳后，对目的条带进行胶回收，回收产物与pMD18-T 载体连接，连接产物转化DH5α 感受态细胞，然后将其涂在氨苄板上，37 ℃温箱内培养过夜；挑取单个白色菌落，接种到含有氨苄的LB 液体培养基，37 ℃摇床培养8 h 以上；对菌液进行RT-PCR 检测，将阳性菌液送至生工基因公司进行测序。将测序结果拼接，采用MegAlign 软件将检测序列与NCBI 中发表的已知序列（表3）进行比对，并采用邻接法（MEGA6.0 软件）构建进化树。

表3 不同基因型ARV 参考序列

2 结果

2.1 RT-PCR 检测

对253 份疑似ARV 感染样品进行RT-PCR 检测，检出ARV 阳性157 份，平均阳性检出率为62.1%；6 个省份均有阳性检出，其中山东的阳性检出率为64.2%（68/106），福建为58.6%（34/58），江苏为60.5%（23/38），辽宁为77.3%（17/22），安徽为55.0%（11/20），河北为44.4%（4/9）。具体检测结果见表4、图3。

表4 2020—2021 年疑似ARV 感染样本检测统计结果

2.2 σC 基因分子进化分析

将157 份ARV 阳性样本进行σC基因序列测序，然后与GenBank 上发表的ARV 参考毒株构建系统发育树进行比对。结果显示：157 份ARV 阳性样本共分为6 个基因型。61 份（38.8%）属于基因1 型，其中38 份与标准ARV 疫苗株（S1133）属于同一亚分支，另外23 份处于单独分支，与4599 参考株处于另一亚分支；41 份（26.11%）为基因2 型，15 份（9.6%）为基因3 型，9 份（5.73%）为基因4型，30份（19.11%）为基因5型，1份（0.64%）为基因6型。根据σC基因构建的系统发育树见图4。

3 讨论

ARV 是无囊膜的dsRNA 病毒，其基因组由10 个节段组成。其中S1基因片段的σC基因编码的细胞附着蛋白，是ARV的主要抗原决定簇。因此，σC基因常被用作ARV 毒株分型的依据[6]。根据σC基因不同，可将其分为6 种基因型[7]。ARV 容易变异重组。近年来，美国、巴西、日本、韩国等国家均有种鸡免疫过ARV 商品化疫苗（如1133、1733、2408）但下一代鸡群仍然发病的现象。国外学者对ARV 分离毒株σC基因进行分析研究发现，目前广泛使用的商品化疫苗（如S1133、1733、2408 等）均为基因I 型，而ARV 的临床分离株多为基因2～6 型，而且不同基因型之间的交叉保护存在较大差异[7-8]。

近年来，我国白羽肉鸡群ARV 感染的发病率呈明显上升趋势[4]，造成发病鸡跛行、行走困难、撇腿等，尤其是屠宰时青腿现象异常增加，造成废弃率升高，给养殖企业带来了较大困扰。针对该问题，我国学者也做了相关研究[9-10]，发现国内存在多种基因型ARV 流行，其与广泛使用的经典疫苗株S1133 有较大差异。本调查对我国部分省份的157 份ARV 阳性样品进行σC基因分析，发现6 种基因型在我国均有流行，与国内此前的研究[4，9，11-12]结论一致。本次研究还系统分析了国内部分省份的不同ARV 基因型占比，发现基因1 型、2 型、5 型占比较高。其中，基因1 型分属于2 个不同的分支，两分支同源性仅为73.9%～76.7%，说明我国存在基因1 型变异毒株。从以上分析结果来看，我国流行的ARV 基因型较为复杂。从送检样品的上游种鸡群免疫背景来看，大多免疫过经典ARV 株疫苗（如S1133、2408 等），但保护效果不甚理想，说明当前的疫苗株已不能对国内流行的ARV 提供足够的保护，需要进一步开展监测，评估病毒流行及变异情况，调整免疫策略，加快新疫苗等疫病防控新技术、新产品研发。