福建省部分养殖场鸡圆圈病毒3 型病原检测及VP2 基因分析

林裕胜，余明兴，陈长福，张 龙，江锦秀，张靖鹏，刘维巍，，刘庆华，胡奇林

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州 350013；2.浦城县动物疫病预防控制中心，福建浦城 353400；3.龙岩市动物疫病预防控制中心，福建龙岩 364000；4.福建农林大学动物科学学院，福建福州 350002）

圆圈病毒3 型（gyrovirus 3，GyV3）属于细环病毒科（Anelloviridae）圆圈病毒属（Gyrovirus）A 分支。该分支包括鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）、人环状病毒（human gyroviruses，HGyV）、禽环状病毒2（avian gyrovirus 2，AGV2）、环状病毒6（gyrovirus 6，GyV6）、环状病毒7（gyrovirus 7，GyV7）和环状病毒9（gyrovirus 9，GyV9）[1]。2012 年，Phan等[1]从急性胃肠炎患儿粪便中首次检测出GyV3；2018 年，Li等[2]首次从患有典型鸡传染性腺胃炎的病鸡腺胃中鉴定出GyV3。2020 年，袁世玉[3]通过鸡和小鼠致病性试验证实：GyV3 可引起鸡的传染性腺胃炎和贫血，并且可跨种感染小鼠，引起小鼠胃肠炎和贫血；该病毒在鸡群和鼠群中均呈水平传播。

GyV3 基因组大小为2 356～2 359 bp，含有3个同向重叠的开放阅读框架，以及衣壳蛋白基因VP1、骨架蛋白基因VP2和凋亡蛋白基因VP3，其中VP2基因大小为720 bp，编码239 个氨基酸[1-2]。CIAV 的VP2基因编码非结构蛋白，其较为保守，常作为分子流行病学检测的首选基因[4]。而GyV3 与CIAV 的VP2基因编码蛋白氨基酸序列同源性为63%左右，又同属一个分支，为此本研究选用VP2作为目的基因进行遗传变异分析。2018 年GyV3 在肉鸡中被鉴定出来后，2021 年在福建省龙岩市部分鸡场中也检测到了该病毒[5]。为进一步了解GyV3 在福建省养鸡场的流行及其VP2基因变异情况，2021 年在福州市、南平市、龙岩市等家禽养殖区，采集疑似腺胃炎病鸡的腺胃样品进行GyV3 核酸检测，并对部分阳性样品进行VP2基因序列分析。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、GyV3 分离株，均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所畜病室分离、鉴定及保存。EasyPure Genomic DNA Kit、pEASY®-Blunt Zero Cloning Kit，购自北京全式金生物技术有限公司；CataAmp High Fidelity PCR Mix，购自北京开拓思生物技术有限公司；DNA Marker，购自宝生物（北京）工程有限公司；凝胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。2021年在福州市、南平市、龙岩市等36 个养鸡场采集疑似腺胃炎的病鸡腺胃样品365 份。

1.2 引物设计

下载GenBank 中收录的8 株GyV3 全基因组序列中的VP2基因，经对比分析后选用从肉鸡上分离的GyV3 SDAU-1 株（No.MG366592）VP2基因序列作为引物设计的参考基因，利用oligo 7 软件设计1 对特异性引物（上游VP2F：ATGTCATCCGGCGGTCTAG；下游VP2R：TTACCAGGTAAGATCCCGGATG），扩增片段大小为720 bp，委托铂尚生物技术（上海）有限公司合成。

1.3 样品处理

在生物安全柜中，将每份腺胃组织样品用剪刀剪碎，按1:5 的体积比加入PBS 研磨成浆，将研磨后的匀浆于-20 ℃冷冻保存。经冻融3 次后，5 000 r/min 离心15 min，取上清液备用。

1.4 核酸提取

按照EasyPure Genomic DNA Kit 说明书提取上清液DNA。

1.5 PCR 检测

PCR反应体系：CataAmp High Fidelity PCR Mix 10 μL，VP2 F/R 引物各1 μL，1.4 中提取的核酸3 μL，无菌去离子水补足至20 μL。反应条件：95 ℃，5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 个循环；72 ℃，7 min。反应结束后，产物经1%琼脂糖凝胶，125 V 电泳25 min，置于凝胶成像系统下观察并保存结果。

1.6 VP2 基因克隆与序列分析

将PCR 检测阳性的代表样品，通过胶回收试剂盒回收目的片段，连接pEASY®-Blunt Zero Cloning Vector，转入大肠杆菌DH5α 菌株，挑取单个菌落；将经PCR 鉴定为阳性的克隆质粒送至福州博尚生物有限公司进行测序，测序结果利用MegAlign 和MEGA7.0 软件进行序列比对和遗传进化树分析。参考毒株序列见表1。

表1 GyV3 参考毒株相关信息

2 结果与分析

2.1 临床样品PCR 检测

在福州市、南平市和龙岩市36 个鸡场采集的365 份临床样品中，检出GyV3 核酸阳性55 份，阳性检出率为15.06%。部分临床样品的PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

2.2 VP2 基因序列分析

将检出的5 份代表性阳性样品FJ-FZ2021（福州）、FJ-LY2021（罗源）、FJ-SH2021（上杭）、FJ-WP2021（武平）、FJ-YP2021（延平）获得的VP2基因序列提交到GenBank（取得的登录号分别为ON012548、ON012549、ON012550、ON012551、ON012552），通过MegAlign 软件进行序列同源性分析。结果显示：5 份GyV3 阳性样品的VP2基因均由720 个碱基组成，编码239个氨基酸；与山东SDAU-1 株VP2基因相比存在7～12 个碱基突变（表2）。5 份GyV3 阳性样品的VP2基因核苷酸和推导氨基酸序列相似性分别 为98.6%～99.9% 和98.3%～100%，与Group A分支中山东SDAU-1 株的核苷酸和推导氨基酸序列相似性分别为98.3%～99.0%和97.5%～99.2%，与GyV3 吉林分离株（17HRB0905、17CC0711、17CC0704）的核苷酸和推导氨基酸序列相似性分别为98.5%～100%和98.3%～100%，与巴西参考株（BR_DF5、GyV3）的核苷酸和推导氨基酸序列相似性分别为98.5%～99.2%和97.5%～99.2%，与智利FecGy 参考株的核苷酸和推导氨基酸序列相似性分别为99.2%～100%和98.3%～100%，与匈牙利G19 参考株的核苷酸和推导的氨基酸序列相似性分别为86.6%～87.1%和83.5%～84.7%；与 Group A 分支中HGyV、AVG2、GyV6 参考株的核苷酸序列相似性为76.1%～77.5%，与 Group B 分支的核苷酸序列相似性为39.2%～39.7%，与 Group C 分支的核苷酸序列相似性为55.2%～57.1%（图2）。

表2 5 份GyV3 阳性样品VP2 基因核苷酸变异情况

3 讨论

鸡传染性病毒性腺胃炎（transmissible viral proventriculitis，TVP）自1996 年在我国江苏省报道以来，现已在全国广泛流行[2]。然而TVP 的致病因素较多，目前已知IBV、网状内皮组织增生症病毒（reticuloendothelial virus，REV）、腺胃坏死病毒（chicken proventricular necrosis virus，CPNV）、传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）、J 亚群禽白血病病毒（avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）、马立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）、CIAV、腺病毒（adenovirus，AdV）均能引起TVP[6-13]，因此想要通过疫苗免疫来预防该病的发生显然难以实现。Li等[2，14]2018 年利用高通量测序方法，在传染性腺胃炎病鸡的肿大腺胃中鉴定出了GyV3，进一步研究发现，该病毒能够引起鸡免疫抑制、贫血以及腺胃肿大等TVP 典型症状。然而至今还没有任何防控手段能够预防GyV3 感染的发生，因此只有通过流行病学监测，及时淘汰阳性鸡群，才能有效减少养殖企业的经济损失。

GyV3 感染是近年来新发现的疫病，还未引起有关机构和部门的足够重视，相关流行病学资料较少。山东农业大学成子强团队中的贾梅玉[15]对336 份患有TVP 的肉鸡进行了流行病学调查，结果检出42 份GyV3 核酸阳性样品，阳性检出率为12.5%；陈长福[4]对龙岩市297 份病死鸡组织样品进行了GyV3 核酸检测，结果检出核酸阳性样品52 份，阳性检出率为17.51%。本研究从36个鸡场采集365 份疑似TVP 病鸡的腺胃样品进行GyV3 核酸检测，结果检出阳性样品55 份，阳性检出率为15.06%，与陈长福[4]的研究结果相近，表明GyV3 已在福建省部分地区鸡场中流行。但是以上研究仅做了病原检测，获得了流行病学资料，未对GyV3 相关基因进行遗传变异分析。

VP2作为GyV3 第二大开放阅读框，与CIAVVP2推导氨基酸序列同源性为63%；VP2基因推导的非结构蛋白可能作为支架蛋白或者分子伴侣，在CIAV 核酸复制和病毒装配过程中起着十分重要的作用[16]。通过GyV3VP2序列比对分析发现，5份阳性样本中的VP2基因均由720 个碱基组成，编码239 个氨基酸，与山东SDAU-1 株VP2基因相比存在7～12 处碱基差异。5 份阳性样本的GyV3VP2基因核苷酸和推导氨基酸序列相似性分别为98.6%～99.9%和98.3%～100%；除匈牙利G19 毒株外，与GyV3 不同宿主分离株同源性均在97.5%以上，与Group A 分支的HGyV、AVG2、GyV6 核苷酸序列相似性为76.1%～77.5%，与Group B 分支的核苷酸序列相似性为39.2%～39.7%，与Group C分支的核苷酸序列相似性为55.2%～57.1%。因此，VP2基因可作为GyV3 感染流行病学监测的首选基因。

综上所述，本研究证实了福建省部分地区鸡养殖场存在GyV3 流行，其VP2基因序列基本稳定，可作为该病毒核酸检测的目标基因。