比较三种不同固定液对淋巴结冷冻切片染色质量的影响

姜阳阳，成志强，游淑源

淋巴结活检的主要作用是对恶性肿瘤淋巴转移进行分级，明确肿瘤转移的具体范围，减少不必要的手术及术后并发症[1]。术中冷冻切片能在较短时间内获得淋巴结的病理诊断结果，对手术治疗方式和手术范围具有较高的指导作用，因此越来越受到临床医师的青睐。淋巴结组织由于其细胞丰富，质地较脆，外围常有脂肪包绕，在日常冷冻切片工作中较难获取高质量切片。固定是影响冷冻切片质量的主要因素之一[2]，组织固定欠佳直接导致染色质量差，严重影响诊断的准确性。本科室采用不同固定液对淋巴结冷冻切片进行HE染色，取得良好的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2020年6～8月我院手术室送检新鲜淋巴结标本，淋巴结直径均大于0.5 cm，合计30枚，均符合快速病理标本送检要求。

1.2 试剂及仪器试剂：甲醇，冰醋酸，Harris苏木精染色液，伊红(醇溶性)，樱花OCT包埋剂，无水乙醇，二甲苯，1% 碳酸锂水溶液，中性树胶等。A液 ∶甲醇；B液：冰醋酸-甲醇液(冰醋酸 ∶甲醇=5 ∶95)；C液：冰醋酸-95%乙醇液(冰醋酸 ∶95%乙醇=5 ∶95)。仪器：恒温冷冻切片机(Leica CM1950)，生物显微镜(OLYPMUS BX40)。

1.3 方法送检的新鲜淋巴结组织，规范取材后行冷冻切片。实验前将A、B、C液放置在冷冻切片机内，预冷至机箱温度(-20 ℃)。常规冷冻切片(5 μm厚)，每例淋巴结连续做 9张切片，分别浸泡于3种不同固定液中，固定时间分别为 15、30、60 s。待固定完成后，流水冲洗，收集所有切片置于染色架中，流水冲洗20 s后染色。染色步骤：苏木精染色液60 s，流水冲洗10 s，1%碳酸锂水溶液返蓝5 s，流水冲洗10 s，伊红溶液10 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 结果判断所有切片均由本科室两名副主任医师采用双盲法阅片，从组织结构、细胞核形态、细胞核染色、细胞质染色和核质对比等5项进行评分，单项总分为10分，无法诊断计为0分。

2 结果

2.1 HE染色本实验经A液固定15、30 s的切片：镜下组织结构不清晰，细胞核肿胀，核染色和胞质染色对比度差。本实验经C液固定15、30 s的切片：镜下见细胞间隙增大，细胞核轻度缩小，细胞核和细胞质对比度较好。本实验经B液固定15、30、60 s的三组切片：镜下组织结构均完整，细胞形态清晰，核仁清晰可见，细胞核和细胞染色良好。经A液固定60 s的切片和经C液固定60 s的切片：组织结构均清晰，未见细胞肿胀和收缩，核质对比度好(图1～4)。

2.2 评分本组结果显示：A液组和C液组平均分随着固定时间延长而逐渐增加，平均得分：固定60 s>固定 30 s>固定15 s。B液组平均分相对较为稳定(表1)。

表1 三种固定液固定不同时间的HE染色评分

2.3 单因素方差分析固定15 s和固定30 s时，固定液影响冷冻切片HE染色质量(P<0.01)，平均分：B液组>C液组>A液组。进一步两两比较，B液组和其他两组评分差异有统计学意义(P<0.01)，提示冷冻切片在B液中固定15、30 s时染色质量优于其他两种固定液。固定60 s时，方差分析结果表明三种固定液评分差异无统计学意义(P=0.733)，提示固定液不是影响染色评分的因素。进一步两两比较，B液与A、C液组评分差异无统计学意义(P=0.918)，A液组与C液组评分差异无统计学意义(P=0.711)，提示固定60 s时，三组切片均获得良好的染色效果。

图1 淋巴结：A液(甲醇)固定15 s,组织结构不清，细胞明显肿胀

3 讨论

影响淋巴结冷冻切片的因素较多，如规范取材、冷冻速度、切片技巧、固定和染色均是影响切片质量的主要因素。淋巴结通常多份标本同时送检，淋巴组织内掺杂脂肪，制片难度大，切片时间长，诊断难度大，而淋巴结冷冻切片的诊断直接关系手术进度和手术方式。淋巴结内纤维少，细胞丰富，尤其是核质比高的淋巴细胞染色质极为丰富，良好的固定十分重要。优质的固定液，不仅能保证组织形态原有结构的完整功能，还能最大限度减少冷冻切片与石蜡切片在组织细胞形态上的差异[3]。

本实验评估淋巴结冷冻切片经3种固定液固定，HE染色均获得高质量的淋巴结冷冻切片，镜下表现为组织结构清晰、颜色鲜艳，细胞核呈蓝色，细胞质呈不同程度红色，细胞形态清晰，细胞核规则，细胞间隙无明显增大，核质对比度良好，核仁和染色质清晰。甲醇为沉淀类固定剂，对组织渗透性强，能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白[4]。95%乙醇对抗原性保存较好，能沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，但核蛋白被沉淀后溶解于水，造成组织收缩。因此，95%乙醇作为单纯的固定液不理想[5]。多项研究证实，固定液中添加一定浓度的冰醋酸对细胞破坏小，细胞核、细胞质染色对比鲜明，本实验也获得类似的结论。

冷冻切片固定时间不够主要表现为细胞核肿胀，染色对比度差，组织结构不清晰，细胞收缩等。本次实验中对比了不同固定时间对淋巴结冷冻切片HE染色质量的影响，获得高质量的染色切片，甲醇和冰醋酸-95%乙醇液需要固定60 s，而冰醋酸-甲醇液只需固定15 s，明显优于另外两种固定液。冰醋酸的穿透能力强，能沉淀核蛋白，可较好地保存染色体的结构，冰醋酸加速蛋白质沉淀，尤其核蛋白沉淀，提升细胞核染色质量。冰醋酸-95%乙醇液固定未见核蛋白溶解，切片显示细胞核和细胞质染色质量较高，短时间固定会引起细胞收缩，但不影响诊断。冰醋酸对组织有膨胀作用，经冰醋酸-95%乙醇液固定60 s，冷冻切片染色质量高，未见明显细胞间隙，95%乙醇能快速引起细胞收缩，而冰醋酸对组织的膨胀作用较缓慢，95%乙醇的收缩作用与冰醋酸的膨胀作用相抵消需要固定时间，实验证明在固定60 s时取得较好的效果。

本实验显示冰醋酸-甲醇混合液配制简单，固定时间短，效果好，有利于快速制片，是一种理想的淋巴结冷冻切片固定液。