低氧处理的hAMSCs外泌体对巨噬细胞M1/M2分型影响及其分子机制

江鑫铭,李霄霞,赵春华

(青岛大学基础医学院,山东 青岛 266071)

间充质干细胞(MSCs)是一类具有高度自我更新能力、多向分化潜能、低免疫原性及重要免疫调节能力的多能成体干细胞[1]。因较易获取且易于分离提取，人脂肪间充质干细胞(hAMSCs)的临床研究较为广泛。由于MSCs在体外培养时，通常处于常氧状态中，即培养环境中氧气的体积分数为0.209左右，但是在自然生理条件下，体内环境中氧气的体积分数只有0.02～0.08，甚至更低。所以，研究低氧状态下的MSCs更有利于将来其临床应用。

外泌体是由细胞分泌的来自细胞内多囊泡体的一种脂质双分子层组成的囊泡，是MSCs旁分泌作用和细胞间通讯的重要递质[2]。它们可以通过转移分子货物来影响受体细胞的功能，例如蛋白质、微小RNA(miRNA)和mRNA等[3-4]。与干细胞相比，源自MSCs的外泌体具有很多优点，例如更容易通过组织屏障，能减少排斥反应的风险[5]。

巨噬细胞作为人体内重要的抗原呈递细胞和免疫调节细胞，在多种疾病中发挥重要作用[6]。巨噬细胞根据其不同的激活方式和发挥免疫功能方式，分为M1型和M2型。M1型巨噬细胞为促炎性的，M2型巨噬细胞为抑炎性的[7]。MSCs能调节巨噬细胞由M1型向M2型转化来减轻炎症反应以及加速损伤修复[8]。有研究表明，在硫酸葡聚糖诱导炎症性肠病小鼠模型中，腹腔注射MSCs可诱导 M2 型巨噬细胞产生从而明显改善结肠炎症[9]；在肾动脉狭窄损伤模型中，MSCs可以通过调控巨噬细胞表型改善肾功能[10]。本研究旨在探讨低氧状态下hAMSCs外泌体对巨噬细胞M1/M2分型的影响及其分子机制，为其将来应用于临床治疗奠定基础。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

本实验所用的hAMSCs来自于吸脂术病人术后废弃的脂肪组织(已经征得病人的知情同意)，经提取原代细胞后扩增所得。巨噬细胞RAW264.7为实验室自存细胞系。本实验所用的RPMI、高糖DMEM和DME/F12培养液均购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自Ex-cell公司；青霉素、链霉素、总RNA提取试剂、胰蛋白酶、RIPA裂解液、抗体稀释液均购自新赛美公司；胶原酶P购自美国Roche公司；脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix试剂盒购自上海翊圣公司；PBS缓冲液购自biosharp公司；直标抗体CD80、CD206购自美国BD公司。

1.2 hAMSCs的分离培养

取废弃脂肪组织用PBS冲洗后分装至离心管中，以700 r/min离心3 min后吸弃PBS，加入2 g/L胶原酶P适量，置37 ℃恒温摇床中消化30 min，消化液经过100目滤网过滤滤去未消化组织后加入足量PBS，以1 000 r/min离心5 min，弃上清，留底部细胞沉淀。重复2次后，将细胞沉淀重悬接种于含体积分数0.10胎牛血清的DME/F12培养液中，置于37 ℃恒温CO2培养箱内培养，每2 d换液1次，待细胞生长至约80%融合时进行传代培养。

1.3 hAMSCs外泌体的提取及鉴定

将第5代hAMSCs细胞接种于10 cm培养皿中，待细胞生长至80%～90%融合时，换无血清高糖DMEM培养液，将细胞置于低氧小室(氧气的体积分数为0.025)培养24 h，取上清液置于分子量为100 000规格的离心过滤器内，以3 500 r/min离心30 min，收集离心过滤器内的外泌体。使用透射电子显微镜观察并拍摄外泌体，使用纳米颗粒追踪分析仪进行外泌体粒径检测，采用Western blot方法检测外泌体相关标志蛋白表达。

1.4 巨噬细胞M1/M2表型诱导以及流式细胞术鉴定

巨噬细胞正常生长至80%左右融合时进行传代，接种于6孔板中，培养48 h后换无血清RPMI培养液。设置2孔为对照组(A组)，2孔为单纯LPS诱导组(B组)，2孔为LPS和hAMSCs外泌体共处理组(C组)。对照组无处理措施；单纯LPS诱导组加入浓度为1 mg/L的LPS诱导12 h，以PBS洗去LPS，换无血清RPMI培养液继续培养24 h；LPS和hAMSCs外泌体共处理组首先加入浓度为1 mg/L的LPS诱导12 h，以PBS洗去LPS后换无血清RPMI培养液，然后加入浓度为50 mg/L的hAMSCs外泌体继续培养24 h。收集细胞、RNA和蛋白进行鉴定。用胰蛋白酶消化后收集细胞，以PBS清洗、重悬，加入CD80直标抗体4 ℃下孵育30 min，以PBS清洗2次，洗去未结合直标抗体，用PBS重悬细胞；以PBS清洗、重悬，用40 g/L多聚甲醛固定3 min，以PBS洗去多聚甲醛后用体积分数0.001的tritonX重悬细胞，同时加入CD206直标抗体4 ℃孵育30 min，以PBS洗2次洗去残留的tritonX和直标抗体后用PBS重悬。采用流式细胞术检测CD80和CD206在各组细胞的表达。实验重复3次。

1.5 实时荧光定量PCR(qPCR)检测巨噬细胞炎症因子表达

按总RNA提取试剂说明书提取各组RNA，随后按照逆转录试剂说明书进行总RNA的逆转录。先进行残留组基因的去除，条件为42 ℃、2 min；然后进行逆转录，条件为25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。按照荧光定量所需的SYBR Green Master Mix试剂盒使用说明配制反应体系，设置反应条件：预变性95 ℃、5 min，变性95 ℃、10 s；退火/延伸60 ℃、30 s，循环39次。实验所用基因引物序列见表1。以GAPDH为内参照基因，采用2-△△Ct方法计算肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、一氧化氮合酶2(NOS-2)和白细胞介素12(IL-12)的mRNA表达水平。每组样本设置3个副孔，实验独立重复3次。

表1 PCR引物及其序列

1.6 Western blot检测核因子κB(NF-κB)通路相关蛋白表达

细胞加入RIPA裂解液裂解后提取细胞总蛋白，参照SDS-PAGE凝胶试剂盒操作说明书在制胶后采用恒压电泳将所提取的蛋白样品分离，然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。使用100 g/L的脱脂奶粉室温封闭90 min，加入一抗(β-actin、P65、p-P65，以1∶1 000抗体稀释液稀释)4 ℃孵育过夜，加入羊抗兔二抗(以1∶5 000抗体稀释液稀释)室温孵育60 min。使用超敏ECL发光检测试剂盒进行显影。应用Image J软件分析蛋白电泳条带灰度值，以β-actin作为内参照蛋白，计算P65、p-P65蛋白的相对表达量。实验独立重复3次。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 低氧处理的hAMSCs外泌体的鉴定

应用超速离心法提取了低氧处理的hAMSCs的外泌体，在电镜下观察其形态为盘状囊泡形(图1A)。使用纳米粒径分析仪检测外泌体直径分布，结果显示直径118.5 nm的外泌体占比为95.8%(图1B和表2)。Western blot方法检测外泌体相关标志蛋白的表达，结果显示，只能检测到外泌体标志蛋白TSG101的表达，而没有检测到细胞质特异性蛋白CALNEXIN的表达(图1C)，表明所提取的盘状囊泡是外泌体而非胞质部分。

2.2 巨噬细胞炎症因子表达情况和流式细胞术检测细胞表型

qPCR检测结果显示，相较于对照组，加入LPS诱导后巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、NOS-2和IL-12的mRNA相对表达量显著升高；而LPS和hAMSCs外泌体共处理组细胞与单纯LPS诱导组细胞相比较，上述炎症因子mRNA的相对表达量明显下降，差异均有统计学意义(F=10.820～222.942，P<0.05)。表明经低氧处理的hAMSCs外泌体可以降低M1型巨噬细胞炎症因子的表达。见表3。

流式细胞术检测结果显示，与单纯LPS诱导组相比，LPS和hAMSCs外泌体共处理组M1型巨噬细胞比例下降，M2型巨噬细胞比例增加(t=3.293、10.242，P<0.05)。见表4和图2。

表2 hAMSCs外泌体粒径峰值分析

表3 各组巨噬细胞炎症因子mRNA相对表达水平的比较

表4 两组M1型、M2型巨噬细胞标志物表达的比较

2.3 巨噬细胞NF-κB信号通路蛋白的变化

本文Western blot检测结果显示，对照组、单纯LPS诱导组、LPS和hAMSCs外泌体共处理组细胞的p-P65/P-65蛋白表达比值分别为0.602±0.032、1.560±0.035和1.251±0.059(n=3)。与单纯LPS诱导组相比，LPS和hAMSCs外泌体共处理组细胞p-P65蛋白表达减少(图3)，p-P65/P-65蛋白表达比值下降，差异具有统计学意义(F=375.634，P<0.05)。表明M1巨噬细胞经外泌体处理后其NF-κB信号通路受到抑制。

A：低氧处理的hAMSCs外泌体电镜下形态；B：纳米粒径分析仪检测低氧处理的hAMSCs外泌体的直径分布；C：Western blot方法检测TSG101蛋白和CALNEXIN蛋白表达情况。

流式细胞术检测两组细胞CD80、CD206表达，CD80为M1型巨噬细胞标志物，CD206为M2型巨噬细胞标志物。

A、B、C分别为对照组、单纯LPS诱导组、LPS和hAMSCs外泌体共处理组。

3 讨 论

MSCs是一种多潜能干细胞，具有免疫调节特性(包括免疫抑制和免疫促进)和低免疫原性[11-13]，已被应用于多种治疗中。但是MSCs的体内治疗的效果与体外实验结果存在差异，体内治疗效果通常不如体外实验结果[14-16]，所以越来越多的研究选择将MSCs进行预处理以后再应用于治疗。本研究对MSCs进行低氧处理以模拟其在体内条件下所处的气体环境。

有研究表明，MSCs在全身给药后存活不到1周，但其治疗效果可以持续产生，由此可见MSCs的免疫抑制功能至少部分是由旁分泌介导的，其中外泌体可能是主要的活性媒介[17-19]。外泌体是细胞间通讯中独特的分泌性囊泡，是具有双层膜结构的膜囊，含有复杂而丰富的蛋白质、核酸和其他活性分子[20]，其功能涉及多个方面，包括免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化和肿瘤侵袭等。与细胞相比，外泌体具有较低的免疫原性、更强的跨越生物屏障能力以及较少的安全问题等优点[21-23]。MSCs是一种可以产生大量外泌体的细胞，其中骨髓MSCs来源的外泌体正在被探索作为MSCs的治疗替代方案，因为它们可能与细胞具有类似的治疗效果[24]。

本研究旨在探讨低氧处理后的MSCs外泌体对巨噬细胞表型的影响。正常MSCs外泌体对免疫细胞具有免疫抑制作用，如诱导促炎表型Th1细胞向Th2细胞转变、减少促炎因子的分泌、增加抗炎因子的分泌等[25]。MSCs外泌体的免疫抑制作用与其生物活性分子如miRNA和蛋白质有关[26]。已证实，含有miR-142-3p、miR-223-3p和miR-126-3p的MSCs外泌体调控树突状细胞成熟，并在其他疾病模型中促进其抗炎潜能[27]。巨噬细胞作为免疫细胞的一员，同样受MSCs外泌体的免疫调控。巨噬细胞作为天然的免疫细胞，在免疫反应和组织修复中起重要作用[7，28]。MSCs外泌体通过诱导抗炎M2巨噬细胞的产生和抑制促炎因子的表达来触发免疫抑制效应[29]。本研究结果显示，低氧处理的hAMSCs外泌体同样可以诱导巨噬细胞由促炎M1型向抑炎M2型转化，并且可以使巨噬细胞炎性因子表达下降。本研究同时检测了NF-κB信号通路的P65和p-P65蛋白的表达情况，结果显示，与单纯LPS诱导组相比，LPS和hAMSCs外泌体共处理组细胞p-P65/P65蛋白表达比值明显降低，表明M1型巨噬细胞NF-κB信号通路受到抑制。提示MSCs外泌体对巨噬细胞表型的影响是通过抑制NF-κB信号通路实现的，但这一信号通路更精确的影响因子仍需进一步的实验来探究。例如已有研究发现，三结构域蛋白(TRIM)家族是天然免疫系统不可或缺的组成成分，作为E3泛素连接酶的成员可以使视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)降解[30-32]，而RIG-Ⅰ是NF-κB信号通路的重要成员[33]。低氧处理的MSCs外泌体是否是通过RIG-Ⅰ抑制NF-κB信号通路仍需进一步实验研究。

总而言之，MSCs具有抗炎和免疫调节能力，长期以来科研人员一直致力于将MSCs应用于多种免疫性疾病的治疗。由于MSCs体内外治疗效果不同，因而在体外对MSCs进行预处理以及使用有类似处理效果的MSCs外泌体进行体外实验是近年来的研究热点。完善与此相关的免疫调节机制信号通路的实验研究有利于MSCs将来的临床应用，从而提升临床治疗效果。