枸橼酸铁铵对少突胶质细胞铁代谢相关蛋白表达影响

王冰菁,张惠琴,谢俊霞,王俊,

(1 青岛大学医学部基础医学院生理学教研室，山东 青岛 266071； 2 中国石油大学(华东)校医院； 3 青岛大学脑科学与疾病研究院)

帕金森病(PD)被认为是世界上第二常见的神经退行性疾病，其主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的缺失[1]。近年来，随着磁共振成像技术的进步，越来越多的证据表明，PD病人黑质中的铁沉积增加[2-3]。铁是一种过渡金属，在生物圈中广泛分布参与电子转移的化学反应，对正常细胞功能至关重要。在铁、亚铁和三价铁之间的氧化还原循环存在于生命所必需的各种反应中[4]。过量的铁会产生有害的活性氧。在大脑中，铁对于维持神经组织的高代谢和能量需求至关重要，并且还参与髓鞘合成、神经递质合成和代谢[5-6]。生成髓鞘的少突胶质细胞维持着大脑中最高的铁浓度[7-8]。少突胶质细胞中含有大量的铁结合蛋白，如铁蛋白和转铁蛋白[9]。已有实验结果证明，在小胶质细胞内，高铁引起二价金属离子转运蛋白1表达下调，铁转运蛋白1(FPN1)表达上调[10]。然而高铁环境对少突胶质细胞内铁代谢相关蛋白的影响目前仍不清楚。本实验旨在探讨枸橼酸铁铵(FAC)对MO3.13少突胶质细胞内铁代谢相关蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

MO3.13少突胶质细胞购于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培养液、胎牛血清购于以色列BI公司，胰酶购于美国Hyclone公司，FAC购于美国Sigma公司，转铁蛋白受体1(TfR1)抗体和FPN1抗体均购于Abcam公司，HRP-IgG标记的二抗购于Absin公司，BCA蛋白定量检测试剂盒购于TherGmo公司，PVDF膜、ECL发光液均购于美国Millipore公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验分组及处理

将未分化的MO3.13少突胶质细胞以6×104/cm2密度接种于6孔板，每孔加入2 mL细胞混悬液培养。为了观察铁过载对TfR1和FPN1表达的影响，将细胞随机分为对照组和FAC组。FAC组用加入100 μmol/L FAC的细胞培养液处理24 h，对照组用无血清细胞培养液处理。

1.3 蛋白质免疫印迹实验检测TfR1和FPN1蛋白表达

药物处理结束以后，收集6孔板内细胞蛋白，应用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，按照每孔总蛋白20 μg计算每个样本的上样量。蛋白经电泳(80 V、30 min和120 V、90 min)、转膜(300 mA、90 min)后，用100 g/L的脱脂奶粉室温封闭1.5 h，再分别加入FPN1(1∶1 000)、TfR1(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)抗体，4 ℃摇床上孵育过夜，然后用TBST溶液洗膜3次(每次10 min)，加入山羊抗兔(1∶10 000)的HRP-IgG二抗室温孵育1 h，再用TBST溶液洗膜3次(每次10 min)，以ECL发光液显影后用Image J软件分析条带灰度值。结果以TfR1和FPN1与β-actin的灰度值比值表示。实验重复8次。

1.4 统计学分析

2 结 果

蛋白质免疫印迹实验检测结果显示，FAC组细胞TfR1表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(t=2.695，P<0.05)，而两组细胞FPN1表达水平比较差异无统计学意义(t=0.210，P>0.05)。见表1。

表1 FAC对MO3.13细胞铁代谢相关蛋白表达影响

3 讨 论

许多神经退行性疾病的特点是中枢神经系统或周围神经系统特定区域的局部铁积累[11]。铁的积累最终可能超过铁的储存能力，从而氧化还原活性铁促进氧化应激[12]。细胞内铁主要用于线粒体合成血红素和铁硫簇。铁也参与DNA合成，核糖核苷酸还原酶是铁依赖性酶，可在真核生物中催化脱氧核糖核苷酸的合成[13]。

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，除了维持髓鞘的功能外，该细胞还维持轴突的完整性，支持轴突代谢，帮助神经元存活[14-15]。神经元和胶质细胞在许多方面都需要铁，包括电子传递、还原型辅酶Ⅱ活性的维持、轴突髓鞘形成以及作为参与神经递质合成的几种酶的辅助因子[16]。细胞内铁含量主要取决于铁吸收和释放蛋白的表达，TfR1被认为是少突胶质细胞生存、生长和成熟的必要条件[17]。TfR1通过受体介导的内吞作用介导细胞对铁的摄取，并在中枢神经系统的神经元和少突胶质细胞中高度表达[18]。少突胶质细胞和小胶质细胞通过FPN1途径介导铁外排[19]。参与脑细胞铁输出的蛋白质缺失或表达减少可能导致大脑中铁的过度积累和神经退行性变，而FPN是哺乳动物中唯一已知的输出细胞内铁的蛋白质[20-21]。哺乳动物的铁代谢受铁调节蛋白(IRPs)的调节，IRPs表达降低，则TfR1表达降低，FPN1表达增加，反之亦然[22]。同时细胞FPN1的表达还受到铁调素(hepcidin)的影响，hepcidin介导FPN1的细胞内吞，hepcidin表达增加，则FPN1表达降低[23]。Hepcidin的表达主要由铁或炎症刺激诱导，铁的摄入刺激hepcidin表达防止高铁血症和进一步的膳食铁吸收[24-25]。已有研究表明，在6-羟基多巴胺处理的小胶质细胞中，二价金属离子转运蛋白1和IRP1表达增加，hepcidin表达降低，FPN1表达无明显变化，FPN1无明显变化可能与IRP1表达增加和hepcidin表达降低有关[26]。而本实验结果显示，未分化的MO3.13少突胶质细胞用100 μmol/L FAC处理后TfR1蛋白表达下降，FPN1蛋白表达不变，FPN1蛋白表达不变可能与hepcidin表达增多和IRP1表达下降共同调节有关。

综上所述，高铁环境下少突胶质细胞内TfR1表达下降，FPN1表达不变，铁转入降低，铁转出不变，以防止细胞铁聚集。本文结果为PD的治疗提供了新的思路和靶点。