外周血淋巴细胞亚群、Treg及细胞因子谱在不同病因血小板减少患者中的差异及意义

李雪梅 邹东梅 孙雪静 李霞 赵义 孙婉玲★

特发性免疫性血小板减少症（Idiopathic im⁃mune thrombocytopenia，ITP）是临床中原发性免疫性血小板减少症的代表，结缔组织病（Connective tis⁃sue disease，CTD）继发血小板减少（CTD⁃TP）是最常见的继发性免疫性血小板减少，是继发性免疫性血小板减少症的代表。研究显示调节性T 细胞（regula⁃tory T cells，Treg）在维持人体的免疫耐受中发挥重要作用［1］，Treg 减少也参与多种结缔组织病的发病［2］。同样，在ITP 发病机制中，细胞免疫异常也具有更重要的作用［3］。Sylvain 等［4］发现ITP 患者体内自身反应性T 细胞增殖，刺激自身反应性B 细胞的增殖和分化，从而产生抗血小板自身抗体，导致血小板减少。为了探索免疫性血小板减少患者中免疫细胞及细胞因子水平的变化规律，本研究同时纳入非免疫机制介导的血液系统疾病合并血小板减少（Hematological disease related thrombocytopenia，HD⁃TP）患者为研究组，比较各组外周血Treg、淋巴细胞亚群、血浆细胞因子谱水平的差异，从而进一步了解免疫性血小板减少的发病机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年1月至2022年2月首都医科大学宣武医院收治的不同病因导致的血小板减少患者61 例作为病例组，按照血小板减少的不同病因分为CTD⁃TP 组21 例，男5 例、女16 例，年龄（55.1±19.7）岁；ITP 组20 例，男6 例、女14 例，年 龄（52.55±20.3）岁；包括系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）12 例，原发性干燥综合（Primary sjogren's syndromejavascript：PSS）9 例；ITP 组20 例，有抗核抗体（Antinuclear antibodies，ANA）阳性6 例。HD⁃TP 组20 例，男8 例、女12例，年龄（58.1±18.5）岁。全部为急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）患者。收集患者的一般资料，包括年龄、性别、病程，外周血Treg，淋巴细胞亚群，血浆细胞因子，血小板计数等指标。另选择同期健康体检者30 名作为正常对照组，男3 例、女27 例，年龄（48.17±15.0）岁。四组间性别、年龄、病程、严重出血情况及合并用药比较差异无统计学意义（P>0.05）。所有研究对象或家属对本研究知情并签署知情同意书。

纳入标准包括：①符合结缔组织病诊断标准［5⁃6］；符合ITP 诊断标准［7］；符合血液系统肿瘤诊断标准［8］；②年龄大于18 岁；③病例组入组需满足血小板小于100×109/L，健康对照组需满足血小板大于100×109/L（两次不同日、间隔一周检测结果）；④患者资料完整。排除标准包括：①合并恶性肿瘤（除外符合血液病入组病例）；②严重感染，肝脾肿大，严重肝肾功能不全，其他继发性血小板减少，哺乳期、妊娠期女性。本研究已通过本院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集

患者空腹12 h，采血前1 天禁忌暴饮暴食和剧烈运动，在患者平静状态下用EDTA 抗凝管抽取静脉血4 mL。

1.2.2 指标检测

1.2.2.1 外周血淋巴细胞亚群检测 绝对计数管中加入50 μL EDTA 抗凝外周血和混合抗体20 μL，包括BD 公司CD3⁃FITC、CD45⁃PerCP⁃Cy5.5、CD4⁃PE⁃Cy7、CD56⁃PE、CD16⁃PE、CD19⁃APC、CD8⁃APC⁃Cy，充分震荡混匀，常温避光孵育20 分钟，加入450 μL 红细胞裂解液，离心、洗涤后上机常规检测淋巴细胞亚群绝对计数。流式细胞仪为BD FACS AriaⅡ。CD3+细胞为总T 细胞，其中CD4+T 细胞为辅助T 细胞、CD8+T 细胞为抑制T 细胞；CD19+细胞为总B 细胞；CD3⁃CD16+CD56+细胞为NK 细胞。

1.2.2.2 外周血Treg 检测 取100 μL EDTA 抗凝外周血荧光抗体标记Treg，所用抗体包括BD 公司HLA⁃DR⁃ FITC、CD4⁃PE⁃Cy7、CD45⁃PerCP⁃Cy5.5和BD Phamingen 公司CD25⁃PE、CD127⁃ PE⁃Cy7，标本处理过程同前。CD3+CD4+CD25+CD127⁃细胞为外周血总Treg 细胞，测定Treg 细胞在CD4+T细胞中的比例。射门策略见图1。

图1 流式细胞术外周血Treg 射门策略Figure 1 Gating strategy of Treg by flow cytometry

1.2.2.3 外周血细胞因子检测 细胞因子试剂盒购自江西赛基生物技术有限公司，检测方法为多重荧光免疫微球法，所测细胞因子包括：IL⁃1β、IL⁃2、IL⁃4、IL⁃5、IL⁃6 、IL⁃8 、IL⁃10、IL⁃12P70 、IL⁃17A、IFN⁃γ、TNF⁃α 、IFN⁃α。EDTA 抗凝外周血离心后取上清血浆，按照说明书步骤进行处理，BD FACS Aria Ⅱ流式细胞仪检测。根据标准曲线计算血浆标本中各细胞因子水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件进行统计分析。计数资料用n（%）表示，行χ2检验。计量资料符合正态分布以（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD⁃t检验；不符合正态分布资料采用非参数检验，组间比较采用Kruskal⁃Wallis 秩和检验（H检验）。外周血Treg、淋巴细胞亚群、细胞因子与不同病因血小板减少病例组血小板水平关系，采用Pearson相关性分析。以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者基线临床资料比较

各组年龄、性别、病程、严重出血情况及合并用药，基线比较差异无统计学意义（P>0.05）。对照组血小板计数显著高于三组研究组患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组基线临床资料比较［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline clinical data in each group［（±s），n（%）］

表1 各组基线临床资料比较［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline clinical data in each group［（±s），n（%）］

注：AML：急性髓系白血病，GC：糖皮质激素；IS：免疫抑制剂；R：利妥昔单抗，SLE：系统性红斑狼疮；pSS：原发性干燥综合征；ANA：抗核抗体。

性别年龄（岁）疾病分类病程（年）血小板（×109/L）严重出血合并用药女性男性CTD⁃TP（n=21）16（76）5（24）55.1±19.7 SLE 12（57）pSS 9（43）4.53±3.0 28.35±15.6 3（14）GC 16（76）IS 18（86）ITP（n=20）14（70）6（30）52.55±20.3 ANA+ 6（30）5.15±4.29 35.45±12.3 4（20）GC 14（70）R 8（40）HD⁃TP（n=20）12（60）8（40）58.1±18.5 AML 20（100）6.9±5.28 27.6±14.7 4（20）GS 17（85）IS 18（90）对照组（n=30）27（90）3（10）48.17±15 4.97±3.78 218±56.93 F/Z 值2.175 1.333 1.167 60.9 1.231 1.388 P 值0.097 0.269 0.327 0.000 0.317 0.251

2.2 各组外周血Treg、淋巴细胞亚群比较

CTD⁃TP 组和ITP 组的Treg 在CD4+T 细胞中的比例均低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；HD⁃TP 组的Treg 高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；CTD⁃TP 组和HD⁃TP 组的总T细胞、CD4+T 细胞和NK 细胞绝对计数均明显低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；ITP组总T 细胞高于HD⁃TP 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组外周血Treg 和淋巴细胞亚群比较（±s）Table 2 Comparison of peripheral blood Treg cells and Lymphocyte subsets between groups with different causes of thrombocytopenia（±s）

表2 各组外周血Treg 和淋巴细胞亚群比较（±s）Table 2 Comparison of peripheral blood Treg cells and Lymphocyte subsets between groups with different causes of thrombocytopenia（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与HD⁃TP 组比较，bP<0.05；与ITP 组比较，cP<0.05。

组别Treg/CD4+T（%）总T 细胞（/μL）CD8+T 细胞（/μL）CD4+T 细胞（/μL）NK 细胞（/μL）B 细胞（/μL）CTD⁃TP 组（n=21）4.89±1.38abc 908±366abc 379±377abc 464±192abc 120±86.55abc 212±7.45abc ITP 组（n=20）5.74±1.42ab 1 101±512ab 371±180ab 622±333ab 242±163ab 183±127ab HD⁃TP 组（n=20）8.58±1.59a 806±318a 314±207a 453±219a 122±93a 122±79.55a对照组（n=30）6.59±2.11 1 293±377 483±203 711±240 362±220 210±86.2 F 值17.059 7.189 2.339 6.081 12.942 3.206 P 值0.000 0.000 0.23 0.001 0.000 0.027

2.3 不同组间外周血细胞因子结果

CTD⁃TP 组IL⁃6，IL⁃8 高于对照组，ITP 组IL⁃6，IL⁃8，IL⁃10，IL⁃1β，IL⁃17A，IFN⁃α，IL⁃12P70 高于对照组，HD⁃TP 组IL⁃8，IL⁃10 高于对照组，CTD⁃TP组IL⁃8，IL⁃1β，IL⁃12P70，IL⁃17A 低于ITP 组，ITP组IL⁃17A，IL⁃12P70 高于HD⁃TP 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 不同病因组间的外周血细胞因子比较（pg/mL，±s）Table 3 Comparison of peripheral blood cytokines between different etiological groups（pg/mL，±s）

表3 不同病因组间的外周血细胞因子比较（pg/mL，±s）Table 3 Comparison of peripheral blood cytokines between different etiological groups（pg/mL，±s）

注:与对照组比较，aP<0.05;与ITP 组比较，bP<0.05；与HD⁃TP 组比较，cP<0.05。

指标IL⁃2 IL⁃4 IL⁃5 IL⁃6 IL⁃8 IL⁃1β IL⁃17A IL⁃10 TNF⁃α IFN⁃α IL⁃12P70 IFN⁃γ CTD⁃TP 组(n=21)1.5±0.86 2.1±1.33 0.58±0.38 8.75±7.93a 5.5±2.28ab 1.78±1.25b 13.99±8.06b 1.93±0.65 1.52±0.93 1.91±1.17 2.38±1.82b 1.57±0.96 ITP 组(n=20)1.57±0.77 1.54±0.69 0.96±0.51 13.56±4.06a 10.19±5.33a 3.39±1.61a 16.34±7.14ac 4.27±3.6a 1.75±0.85 3.49±1.97a 3.93±1.27ac 2.13±1.04 HD⁃TP 组(n=20)0.99±0.72 1.37±0.97 0.55±0.32 5.79±3.48 7.09±3.99a 2.36±2.01 8.98±5.15 2.22±0.82a 2.05±1.24 1.89±1.23 2.81±0.34 1.95±0.63对照组(n=30)1.10±1.05 1.61±1.13 0.79±0.56 2.50±1.63 3.43±1.65 1.31±1.17 8.23±5.49 1.68±0.93 1.37±1.19 1.16±0.86 1.71±1.14 1.86±1.15 F 值2.22 1.75 3.52 8.50 16.12 8.04 18.7 8.87 1.75 12.49 4.87 1.11 P 值0.09 0.16 0.18 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.16 0.00 0.00 0.35

2.4 外周血Treg，淋巴细胞亚群，细胞因子与不同病因血小板减少病例组血小板相关性分析

在CTD⁃TP 组患者中，相关性分析结果显示Treg 细胞比例、NK 细胞绝对值与血小板计数成正相关，血浆IL⁃6、IL⁃8、1L⁃17A 水平与血小板计数成负相关（P<0.05）。见表4。

表4 外周血Treg、淋巴细胞亚群、细胞因子与血小板水平相关性Table 4 Platelet correlation analysis between peripheral blood Treg，Lymphocyte subsets cytokines and thrombocytopenia of different causes in the case groups

3 讨论

本研究结果显示在不同病因引起的血小板减少患者中，均存在不同程度的免疫细胞亚群紊乱和细胞因子水平异常。与对照组相比，CTD⁃TP 组和HD⁃TP 组的外周血CD3+总T 细胞、CD4+T 细胞、NK 细胞及Treg 在CD4+T 细胞中的比例均降低，而这两组之间无统计学差异；细胞因子比较结果显示CTD⁃TP 组和ITP 组血浆IL⁃6、IL⁃8、IL⁃17A水平较对照组升高，而两组的IL⁃8、IL⁃1β 和IL⁃17A 水平有统计学差异。相关分析发现在CTD⁃TP 组，Treg 细胞比例、NK 细胞绝对值与血小板计数成正相关，血浆IL⁃6、IL⁃8、1L⁃17A 水平与血小板计数成负相关。萨仁娜等［9］研究显示，在老年免疫性血小板减少患者存在淋巴细胞减少，本研究结果显示在ITP 组和CTD⁃TP 组CD4+T 淋巴细胞的数量均减少，Treg 细胞降低，这点与文献研究一致。既往文献报道Treg 细胞降低导致自身反应性T 淋巴细胞过度增生，从而产生抗GPⅡb/ⅢalgG血小板抗体的产生，导致免疫性血小板减少［4］。本研究中细胞因子组间比较结果显示，IL⁃6，IL⁃8 在CTD⁃TP 组和ITP 组都高于对照组。Kimura 等［10］研究显示IL⁃6 升高可阻止TGF⁃β 辅助的Treg 细胞分化作用，抑制Treg 细胞增殖，导致Treg 细胞降低，促进CD4+ 初始T 细胞分化为Th17，Th17分泌IL⁃17 促进炎症反应参与血小板减少发病。另外本研究在原发性免疫性血小板减少（CTD⁃TP组）和继发性免疫性血小板减少（ITP 组）两组之间比较发现，IL⁃17A 在ITP 组高于CTD⁃TP 组，表明在ITP 组的Th17 细胞被激活高于CTD⁃TP 组，ITP患者的Th17 升高分泌了更多的IL⁃17A 参与血小板减少发病。文献［11］显示ITP 患者中树突状细胞能够分泌IL⁃6 和IL⁃23 以诱导Th17 产生过多，导致Th17/Treg 失衡，因此推断ITP 中Th17 增多导致Th17/Treg 失衡的原因，而CTD⁃TP 组Treg 细胞减少更明显，更倾向于是Treg 数量减少导致的Th17/Treg 失衡。Takahashi 等［12］研究结果显示，在基因水平上，慢性ITP 组Treg 细胞、Th1/Th2 比值显著高于对照组，Treg 细胞及Th1/Th2 比值与血小板计数呈负相关，而Treg 细胞的降低又是导致Th1/Th2 比值失调的原因之一。

通过本研究结果表明免疫相关血小板减少患者体内免疫系统存在Treg 细胞减少、Th17/Treg 比例失衡、淋巴细胞亚群及细胞因子异常，在CTD 组Treg 细胞降低和IL⁃6、IL⁃8、1L⁃17A 升高与血小板计数存在正相关关系。