基于TCGA数据库分析DARS2在膀胱癌中的临床意义

朱翠雯 柳家翠 王萍 段怡平 陈梁玥 马甜甜 喻明霞 范维★

膀胱癌（Bladder Cancer，BLCA）发生在膀胱黏膜上，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤［1⁃2］。膀胱癌可以分为非肌肉浸润性和肌肉浸润性，其中前者占比70%，复发率高，且20%～30%的非肌肉浸润性膀胱癌进展成为肌肉浸润性［3］。5年总存活率仅为50%左右，而在远处转移的病例中，总存活率将低至5%［4⁃5］。膀胱癌的治疗主要为手术，化疗或二者结合，但治疗预后不佳，复发率较高［6］。膀胱癌的发生与多种因素相关，包括内源性因素和外源性因素。为了能早发现，早治疗，研究者对膀胱癌的分子机制进行了大量的研究。

线粒体天冬氨酰⁃tRNA 合成酶2（aspartyl⁃tRNA synthetase2，mitochondrial，DARS2）基因编码一种线粒体tRNA 合成酶，负责线粒体蛋白质合成的第一步，将氨基酸共价连接到其同源tRNA上，确保遗传密码的正确翻译［7⁃8］。已有的研究表明DARS2基因主要与一种称为脑干和脊髓受累的伴乳酸升高白质脑病（leukoencephalopathy with brainstem and spinal cord involvement，and lactate elevation，LBSL）有 关［7⁃9］。此外，有研究表明DARS2基因通过抑制细胞凋亡和加速细胞周期，与肝癌的发展有着密切的关系［10］。然而，目前尚无研究说明DARS2基因在膀胱癌中的表达差异及意义。本研究通过下载整理癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中2020年12月31日之前纳入的膀胱癌表达谱数据及患者临床信息，分析DARS2在膀胱癌中的表达变化，探讨DARS2与临床病理特征及预后的相关性，并分析DARS2作用相关信号通路。

1 资料与方法

1.1 数据的下载与处理

在TCGA 数据库官方网站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载膀胱癌RNA⁃seq（level 3，HTSeq⁃FPKM）数据，其中包括膀胱癌组织样本410 例，正常膀胱组织样本19 例。利用R.4.0.3 软件和Straw⁃berry Perl 5.32.0.1 软件对下载的基因表达数据进行归一化处理，并通过log2 转化后用于后续分析。在TCGA 数据库下载并提取膀胱癌患者的临床病理特征信息，仅保留生存时间、生存状态、年龄、性别、Stage 分期、T 分期、N 分期、M 分期信息均完整的患者数据。

1.2 DARS2 表达与临床特征和预后的相关性分析

根据DARS2在膀胱癌患者中表达水平的中位值，将膀胱癌患者分为高表达组和低表达组。使用IBM SPSS Statistics 20.0 统计软件分析DARS2表达与患者的年龄、性别、T 分期、N 分期、M 分期、Stage分期的相关性。使用OncoLnc 在线数据库（http：//www.oncolnc.org/）分析DARS2与患者总体生存率（overall survival，OS）的关系。根据TCGA⁃BLCA 数据库中膀胱癌患者的生存数据，结合DARS2的表达量，使用单因素和多因素cox 回归分析对DARS2在膀胱癌患者中的预后价值进行研究。

1.3 DARS2 基因富集分析

使用GSEA 4.1.0 软件进行基因富集分析。以MsigDB（Molecular Signature Database）数据库中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 数据集作为功能基因集。采用缺省加权富集统计的方法，随机组合次数设为1 000 次。以P<0.05 和错误发现率（false discovery rate，FDR）小于0.05 的基因集作为显著富集的基因集。

1.4 统计学分析

使用SPSS 20.0 软件进行统计学分析；计数资料以n（%）表示；使用Mann⁃Whitney U 检验分析DARS2在膀胱癌样本和膀胱正常组织样本中的表达差异；采用卡方检验对DARS2表达与患者临床特征进行相关性分析；生存分析使用Kaplan⁃Meier 法；cox 比例风险回归模型用于评价DARS2的预后意义；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DARS2 在膀胱癌组织中表达显著上调

在TCGA⁃BLCA 数据集中，与正常组织相比，膀胱癌组织中的DARS2的表达显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1A。在配对组织中，肿瘤组织的DARS2表达明显上调，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1B。

图1 DARS2 在膀胱癌组织和正常膀胱组织样本中的表达差异Figure 1 the difference of DARS2 expression between bladder cancer and normal bladder tissues

2.2 DARS2 与膀胱癌患者临床病理特征的联系

DARS2在膀胱癌患者中的表达与Stage 分期（P<0.05）和T 分期（P<0.05）有关。见表1。单因素cox 回归分析中，结果显示，Stage 分期、T 分期、N 分期和DARS2均可以作为膀胱癌潜在的预后因素（P<0.05）；多因素cox 回归分析结果提示，性 别（HR=0.49，95%CI：0.27～0.88，P<0.05）和DARS2（HR=2.08，95%CI：1.34～3.25，P<0.05）可以作为膀胱癌的独立预后影响因素。见表2。

表1 DARS2 表达与膀胱癌患者临床特征的相关性分析［n（%）］Table 1 Analysis of the correlation between DARS2 expression and clinical characteristics of patients with bladder cancer［n（%）］

表2 膀胱癌患者单因素和多因素cox 回归分析Table 2 univariate and multivariate cox regression analysis of patients with bladder cancer

2.3 DARS2 高表达提示患者预后不良

在TCGA 数据库中，DARS2的表达水平与患者的总生存率相关，且高表达组显著低于低表达组，差异有统计学意义（P<0.05）（图2A）；OncoLnc数据库分析结果显示DARS2的表达也与患者的总生存率相关（P<0.05）（图2B）。

图2 DARS2 与膀胱癌患者预后的相关性分析Figure 2 Analysis of the relationship between DARS2 and prognosis of patients with bladder cancer

2.4 GESA 富集分析结果

GSEA 分析结果显示，DARS2主要参与了22 条信号途径（P<0.05，FDR<0.05）。其中包括了细胞周期、RNA 降解、核苷酸切除修复、错配修复、P53 信号通路、DNA 复制等致癌相关的途径。见表3、图3。

图3 DARS2 基因高表达样本相关富集基因集Figure 3 High expression of DARS2 gene in samples correlated with enrichment of gene sets

表3 DARS2 基因GSEA 功能富集分析结果Table 3 results of functional enrichment analysis of DARS2 gene GSEA

3 讨论

膀胱癌是发生在泌尿系统的一种恶性肿瘤，已有报道表明膀胱癌的发生发展与TYRO3，TSC1，HER2，FGFR3，HOXB7等基因突变相关［4，11⁃14］。DARS2基因位于染色体1q25.1，编码线粒体天冬氨酰⁃tRNA 合成酶，对线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）起重要作用［15⁃16］。DARS2基因编码的蛋白属于Ⅱ类氨基酰tRNA 合成酶家族，它是一种线粒体酶，能特异性地将天冬氨酰tRNA 氨酰化［8］。与DARS2相关的疾病主要包括脑干和脊髓受累的白质脑病和乳酸升高，大多数的LBSL 患者具有复合杂合DARS2突变［7，9，17⁃18］。DARS2缺失导致线粒体蛋白质合成严重失调，随后线粒体呼吸链（MRC）大量缺失，这表明DARS2上调可能有助于提高线粒体效率［18⁃19］。DARS2缺失会造成心肌和骨骼肌的线粒体呼吸障碍，而DARS2的过表达则会增强呼吸功能而加速细胞的增殖分化。Kazutoshi 等［20］的研究显示染色体上的DARS2位点通过催化与DNA A 结合的游离ATP 和ADP 之间的核苷酸交换，促进ATP⁃DNA A 的再生。

目前关于DARS2基因的文献较少，而其与肿瘤相关性的研究则更是少之又少。有研究显示DARS2是能促进肝癌细胞周期进程、促进细胞增殖、抑制肝癌细胞凋亡，并且抑制NFAT5 对肝癌细胞的促凋亡作用［10］。此外，研究者发现DARS2蛋白在肝癌组织中的表达显著高于非肿瘤组织，提示DARS2在肝癌组织中存在上调［10］。DARS2基因敲除后细胞周期蛋白D1 的表达降低，提示DARS2促进了肝癌细胞的细胞周期进程。

本研究通过对TCGA 数据库进行数据挖掘，发现DARS2mRNA 在膀胱癌中的表达上调，与膀胱癌的预后相关。并且利用GSEA 富集分析发现DARS2通过多种分子途径参与膀胱癌的发生发展，研究结果提示，抑制DARS2的表达，阻断DARS2介导的信号通路或许可以成为膀胱癌的治疗策略。

综上，DARS2在膀胱癌中存在高表达，并与肿瘤的恶性程度相关，高表达的DARS2提示预后不良。DARS2可以作为一种膀胱癌的独立预后因素，并有望成为膀胱癌治疗的新型分子靶点。