SETDB1⁃siRNA对卵巢癌SKOV⁃3细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制

叶玉锦 吴明秀 黄丽珊

卵巢癌是一种恶性程度极高的妇科肿瘤，因具有发病隐匿、早期诊断困难、肿瘤复发率高和化疗耐药性高等特点使其治疗效果并不十分理想［1］。SET 结构域分支型1（SET domain branch type 1，SETDB1）是一种组蛋白甲基转移酶，属于组蛋白赖氨酸N 端甲基转移酶家族，定位于人类染色体1q21上，具有催使组蛋白H3 第9 位赖氨酸残基（Lysine residue at position 9 of histone histone H3，H3K9）发生甲基化的作用［2］，研究发现SETDB1在急性髓系白血病、乳腺癌和结肠癌等恶性肿瘤中异常表达，能影响细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学行为［3］。已有研究［2］指出，SETDB1在卵巢癌组织中异常高表达，且与患者的不良预后密切相关。本研究以卵巢癌细胞系SKOV⁃3 为研究对象，通过观察干扰SET⁃DB1对SKOV⁃3 细胞恶性生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1640 细胞培养基、胰蛋白酶（美国Gibco），胎牛血清（北京沃比森），Trizol 试剂和脂质体2000（美国Invetrogen），青霉素⁃链霉素双抗、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation，RIPA）裂 解 液（碧 云天），噻唑蓝（Methylthiazolyldiphenyl⁃tetrazolium bromide，MTT）试剂和二甲基亚枫（美国Sigma），兔抗人细胞周期蛋白D1（CyclinD1）单克隆抗体和鼠抗人SET 结构域分支型1（SET domain branch type 1，SETDB1）、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体（美国Abcam），兔抗人基质金属蛋白酶⁃2（matrix metalloprotease，MMP⁃2）多克隆抗体和鼠抗人生存蛋白（survivin）、β⁃连环蛋白（β⁃catenin）、C⁃myc 癌基因蛋白（C⁃myc oncogene protein，C⁃myc）单克隆抗体（美国SantaCruz），辣根过氧化酶标记的二抗（北京中杉金桥）。Matrigel 基质胶、凋亡试剂盒和流式细胞仪（美国BD），逆转录试剂盒（大连宝生物），电化学发光（Electro⁃Chemi⁃Luminescence，ECL）显色试剂盒（上海普飞），聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（上海根生生物），Transwell 小室（美国Costar），凝胶成像仪、电泳仪和电转仪（美国Bio⁃Rad），酶标仪（美国BioTek），CO2培养箱（美国Thermo Scientific），倒置显微镜（美国Olympus）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞来源及其培养

人卵巢癌细胞系SKOV⁃3 购自中科院上海细胞库。用含10%胎牛血清、双抗的1640 细胞培养基在37℃、50 mL/L CO2培养箱培养SKOV⁃3 细胞。

1.2.2 实验分组与细胞转染

实验分为对照组（Ctrl，正常培养）、②组（转染阴性对照NC⁃siRNA）和③组（转染SETDB1 干扰序列SETDB1⁃siRNA），每组设置3 个平行孔。将对数期的SKOV⁃3 细胞，每孔200 μL 接种至6 孔细胞板上，参照脂质体2000 说明书根据实验分组将SET⁃DB1 干扰序列SETDB1⁃siRNA 及其阴性对照NC⁃siRNA 转染至SKOV⁃3 细胞中。其中，SETDB1⁃siRNA（5′⁃GACCUAUCAGGAAUGAGCA⁃3′，5′⁃UGCUCAUUCCUCAUAG⁃GUC⁃3′）和NC⁃siRNA（5′ ⁃ AUGAACGUGAAUUGCUCAATT ⁃ 3′ ，5′ ⁃UUGAGCAAUUCACG⁃UUCACTT⁃3′）由上海吉玛公司合成。转染6 h 后更换培养液，48 h 后收集细胞进行后续实验。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测SETDB1mRNA表达

采用Trizol 法提取SKOV⁃3 细胞总RNA 后，逆转录合成cDNA，将2 μL cDNA（模板）与10 μL SYBR Green Mix、各0.5 μL 的上下游引物、7 μL ddH2O 混匀制成终体积为20 μL 的PCR 反应体系。以GAPDH 为内参，采用2⁃ΔΔCt法检测SKOV⁃3 细胞中SETDB1mRNA 的表达水平。其中，由上海生工生物合成的PCR 引物序列如下：GAPDH 上游：5′⁃GACAACTTTGGCATCGTGGA⁃3′，下游：5′⁃ATG⁃CAGGGATGATGTTCTGG⁃3′；SETDB1上 游：5′⁃TGAGCGAGTCATTGGGCTTT⁃3′，下游：5′⁃TCCT⁃GTGGTCAGGCTCACTA⁃3′。实验重复3 次。

1.2.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测相关蛋白表达

将RIPA 裂解液加待测SKOV⁃3 细胞中提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法进行定量。将热变性后的蛋白样品上样至聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacryl⁃amide gel electrophoresis，SDS⁃PAGE）电泳分离，转膜，封闭2 h，加一抗工作液（SETDB1、β⁃catenin、c⁃Myc、CyclinD1、MMP⁃2 和Survivin）室温孵育2 h。再经二抗工作液（1∶2 000）室温孵育1 h 后，参照ECL 显色试剂盒暗室内显影，采用凝胶成像系统扫描分析SKOV⁃3 细胞中目的蛋白的表达水平。实验重复3 次。

1.2.5 MTT 实验检测细胞增殖

将转染48 h 后②组、③组以及未转染的①组细胞以每孔100 μL 接种至96 孔细胞板上，分别在培养1、2、3 和4 d 后，加10 μL MTT 溶液（5 mg/mL）孵育4 h 后，以150 μL 二甲基亚枫。采用酶标仪检测各组细胞在450 nm 处的吸光度值。实验重复3 次。

1.2.6 Transwell 小室检测细胞侵袭

Matrigel 溶液对Transwell 小室基底膜进行包被，于室温下充分凝固。将各组细胞以无血清培养基进行重悬，浓度为105个/mL。上室中加细胞悬液200 μL，下室加含血清培养基600 μL，孵育24 h，取出小室，拭去上室内的基质胶，甲醛固定30 min、0.5%结晶紫染色15 min。使用倒置显微镜每个样品随机选取5 个视野，观察并统计穿过滤膜细胞数。实验重复3 次。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡

预冷的磷酸缓冲液将收集的②组、③组和①组细胞洗涤2 次后，密度为104个/mL。参照凋亡检测试剂盒说明书上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3 次。

1.3 统计分析

采用SPSS 22.0 进行统计学分析，计量资料以（）形式表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SETDB1⁃siRNA 对SKOV⁃3 细胞中SETDB1表达的影响

与①组相比，转染NC⁃siRNA 后SKOV⁃3 细胞中SETDB1mRNA 和蛋白的表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），转染SETDB1⁃siRNA 可使SKOV⁃3 细胞中SETDB1mRNA 和蛋白的表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。

图1 Western blot 检测SETDB1 蛋白的表达Figure 1 Western blot detection of SETDB1 protein expression

表1 各组细胞中SETDB1 mRNA 和蛋白表达的比较（±s）Table 1 Comparison of SETDB1 mRNA and protein expression in each group of cells（±s）

表1 各组细胞中SETDB1 mRNA 和蛋白表达的比较（±s）Table 1 Comparison of SETDB1 mRNA and protein expression in each group of cells（±s）

注：与①组相比，aP<0.05；与②组相比，bP<0.05。

组别①②③F 值P 值SETDB1 mRNA 1.00±0.00 0.96±0.05 0.31±0.03ab 261.348 0.000 SETDB1 蛋白1.18±0.09 0.97±0.06 0.28±0.03ab 475.071 0.000

2.2 SETDB1⁃siRNA 对SKOV⁃3 细胞不同时间点增殖的影响

转染NC⁃siRNA 后SKOV⁃3 细胞的增殖能力与①组比较，差异无统计学意义（P>0.05），转染SET⁃DB1⁃siRNA 后SKOV⁃3 细胞从2 d 开始增殖能力明显受到抑制，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组细胞在不同时间点的450 nm 处吸光度值比较Table 2 Absorbance values of cells in each group at 450 nm

2.3 SETDB1⁃siRNA 对SKOV⁃3 细胞侵袭的影响

与①组相比，转染NC⁃siRNA 对SKOV⁃3 细胞穿膜细胞数、细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P>0.05），但转染SETDB1⁃siRNA 可使SKOV⁃3 细穿膜细胞数明显减少，细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表3。

图2 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡结果Figure 2 Flow cytometry detection results of apoptosis of cells in each group

表3 各组中穿膜细胞数和细胞凋亡率Table 3 The number of transmembrane cells and the rate of apoptosis in each group

2.4 SETDB1⁃siRNA 对SKOV⁃3 细胞中Wnt/β⁃catenin 信号通路的影响

与①组相比，转染SETDB1⁃siRNA 可明显使SKOV⁃3 细 胞c⁃Myc、CyclinD1、MMP⁃2 和Sur⁃vivin 蛋白的表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），转染NC⁃siRNA 对相关蛋白蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图3 和表4。

表4 各组细胞中β⁃catenin、c⁃Myc、CyclinD1、MMP⁃2 和Survivin 蛋白的表达水平Table 4 Expression levels of β⁃catenin，c⁃Myc，CyclinD1，MMP⁃2 and Survivin proteins in cells of each group

图3 Western blot 检测β⁃catenin、c⁃Myc、CyclinD1、MMP⁃2 和Survivin 蛋白的表达结果Figure 3 Western blot detection of protein expression of β⁃catenin，c⁃Myc，CyclinD1，MMP⁃2 and Survivin

3 讨论

目前，卵巢癌一线治疗方案为放疗或化疗，这也是其晚期患者的主要治疗方式，虽然在一定程度上取得了较大进展，但是复发、远处转移是影响其治疗的关键［4］。因此，选择有效分子基因对提高卵巢癌患者生存率至关重要。

SETDB1在结直肠癌中异常高表达，且上调SETDB1促进癌细胞增殖、侵袭和迁移，并诱导其细胞凋亡［5］。有研究显示，SETDB1基因敲除可通过上调SMAD7抑制乳腺癌细胞转移［6］。研究结果显示，在肝癌组织中SETDB1高表达，下调SETDB1具有抑制肝癌细胞存活和促进细胞凋亡的作用，而该作用是miR⁃621 提高肝癌细胞放射敏感性的重要机制［7］。以上结果说明SETDB1与肿瘤发生密切相关，之前已有研究表明SETDB1在卵巢癌中高表达［2］。本研究结果显示，SETDB1mRNA 和蛋白表达下调，并降低卵巢癌细胞活性，减少穿膜细胞数，增加细胞凋亡率，提示SETDB1⁃siRNA 能抑制卵巢癌SKOV⁃3 细胞增殖、侵袭能力，并诱导细胞凋亡。该结果与前人研究［5⁃6］相似。

Wnt/β⁃catenin 信号通路是比较经典的信号通路，当其激活受阻后，能抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭，并促进细胞凋亡和阻滞细胞周期进展［8］。β⁃catenin 是Wnt/β⁃catenin 信号通路的关键蛋白，其在胞浆内过度积累可进入细胞核，使相关靶基因激活，进而影响细胞增殖、分化、转移和凋亡等促进肿瘤的恶性进展［9］。c⁃Myc是一种原癌基因，在卵巢癌细胞增殖过程中发挥着重要促进作用［10］；CyclinD1 是一种周期蛋白，也是一种促癌基因，在卵巢癌细胞增殖和周期过程有关［11］；MMP⁃2是一种与细胞转移和浸润密切相关的基质金属蛋白酶，与卵巢癌的恶性转移密切相关［12］；Survivin是一种抑转移蛋白，其过表达被认为可能是卵巢癌的临床病理标志物［13］。此外，Wnt/β⁃catenin 信号通路的激活，能影响肿瘤细胞增殖、迁移和凋亡等生物学过程［14］。有研究［15］指出，SETDB1可通过促进Wnt/β⁃catenin 通路活化促进非小细胞肺癌的恶性进展。本研究结果发现，在SETDB1⁃siRNA 转染卵巢癌SKOV⁃3后，卵巢癌细胞中β⁃catenin、c⁃Myc、CyclinD1、MMP⁃2 和Survivin 蛋白下调，这提示SETDB1在卵巢癌细胞中的调控作用与Wnt/β⁃catenin 通路有关，并影响卵巢癌细胞的发展。

综上所述，转染SETDB1⁃siRNA 可抑制SKOV⁃3 细胞增殖、侵袭并促进细胞凋亡，并抑制Wnt/β⁃catenin 信号通路的活化。