孕早期肠道菌群检测对妊娠期糖尿病的预测及评估价值

李岚 刘彩丽 杜杰

妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus，GDM）是常见的妊娠期并发症之一，ADA 将其定义为孕期无糖尿病、在孕中晚期确诊糖尿病的患者。随着近些年我国居民饮食结构的改变，GDM 的发病率也呈逐年升高趋势［1⁃2］，目前国内诊断GDM 主要依靠孕中期的口服葡萄糖耐量试验（OGTT），缺乏孕早期预测GDM 的手段。肠道菌群被视作人体第十大系统、即微生态系统，肠道菌群多样性的改变与2 型糖尿病、肥胖等代谢性疾病的发病有关，调节肠道菌群能够改善糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗［3⁃4］。国内一项GDM 相关的横断面研究证实孕中期肠道菌群的变化与GDM 的发病相关［5］。本文设计了队列研究，在孕早期进行肠道菌群检测、在孕早期进行GDM 评估，具体分析了孕早期肠道菌群检测对GDM 的预测及评估价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2018年3月至2021年8月期间在河南省安阳市妇幼保健院建卡并规律产检的342 例孕妇作为研究对象，纳入标准：①初产妇，单胎妊娠；②孕早期在本院建卡并进行肠道菌群检测；③规律产检，并在孕中期行OGTT；④临床资料完整。排除标准：①孕前有糖尿病、高血压、血脂异常等疾病；②合并甲状腺疾病、自身免疫性疾病；③合并或既往有恶性肿瘤。根据孕中期OGTT 结果将入组的342 例孕妇分为GDM 组（n=32）和对照组（n=310）。GDM 组年龄平均（29.12±7.51）岁，孕前体质量指数（Body mass in⁃dex，BMI）（21.09±5.23）kg/m2，孕早期BMI（21.85±7.41）kg/m2；对照组年龄平均（28.51±4.48）岁，孕前BMI（20.88±4.58）kg/m2，孕早期BMI（21.44±4.85）kg/m2。两组孕妇年龄、孕前及孕早期BMI 的比较差异无统计学意义（P>0.05）。所有入试者及家属均签署知情同意书。本实验经医院伦理委员会批准。

1.2 孕早期肠道菌群的检测

孕早期建卡时，采用粪便核酸保存管（上海伯豪生物技术有限公司）采集新鲜粪便，放置在-80℃保存。检测时，采用粪便DNA 提取试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司）提取粪便中的基因组DNA，采用PCR 试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司）对DNA 进行扩增，所用引物为针对16SrRNA V3⁃V4 可变区的特异性引物，上游引物为5′ ⁃ACTCCTACGGGAGGCAGCAG⁃3′，下游引物为5′⁃GGACTACHVGGGTWTCTAAT⁃3′。得到PCR 产物后，在Illumina Hiseq2500 平台进行测序分析，所得序列在Trimmomatic 软件中根据RDP classifer 贝叶斯算法［5］Ace 指数、OTUs、Chao 1 指数、Shannon 指数、Simpson 指数及厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、瘤胃菌门的丰富度。

1.3 孕中期GDM 的诊断和评估

孕中期进行OGTT，参照《妊娠合并糖尿病诊治指南（2014）》［6］，达到以下任意一条即诊断为GDM：空腹血糖≥5.1 mmol/L、服糖后1 h 血糖≥10.0 mmol/L、服糖后2 h 血糖≥8.5 mmol/L。根据空腹血糖和空腹血胰岛素检测结果，评估胰岛素抵抗程度及胰岛β 细胞功能，胰岛素抵抗指数（HOMA⁃IR）=空腹血糖×空腹血胰岛素/22.5，胰岛β 细胞功能指数（HOMA⁃β）= 20×空腹胰岛素/（空腹血糖-3.5）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计数资料以n（%）表示，行χ2表示。计量资料以（）表示，两组间采用独立样本t检验，GDM 的预测采用ROC 曲线分析，两计量资料间的相关性采用Pear⁃son 检验分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDM 组与对照组孕早期粪便中肠道菌群多样性的比较

与对照组比较，GDM 组孕早期粪便中肠道菌群的Ace 指数、OTUs、Chao 1 指数均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 GDM 组与对照组孕早期粪便中肠道菌群多样性的比较（±s）Table 1 Comparison of intestinal flora diversity in feces of GDM group and control group in the first trimester of pregnancy（±s）

表1 GDM 组与对照组孕早期粪便中肠道菌群多样性的比较（±s）Table 1 Comparison of intestinal flora diversity in feces of GDM group and control group in the first trimester of pregnancy（±s）

组别GDM 组对照组t 值P 值n 32 310 Ace 指数1280.22±308.73 924.69±278.31 6.805 0.000 OTUs 865.82±226.39 552.85±159.84 8.182 0.000 Chao 1 指数1465.41±383.12 1158.28±353.64 8.855 0.000 Shannon 指数4.41±0.98 4.18±0.77 1.565 0.118 Simpson 指数0.039±0.011 0.043±0.012 1.808 0.071

2.2 GDM 组与对照组孕早期粪便中主要肠道菌群丰富度的比较

与对照组比较，GDM 组孕早期粪便中拟杆菌门、变形菌门的丰富度增加，差异有统计学意义（P<0.05），厚壁菌门、放线菌门的丰富度降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 GDM 组与对照组孕早期粪便中主要肠道菌群丰富度的比较（±s）Table 2 Comparison of abundance of main intestinal flora in feces of GDM group and control group in the first trimester of pregnancy（±s）

表2 GDM 组与对照组孕早期粪便中主要肠道菌群丰富度的比较（±s）Table 2 Comparison of abundance of main intestinal flora in feces of GDM group and control group in the first trimester of pregnancy（±s）

组别GDM 组对照组t 值P 值n 32 310厚壁菌门0.33±0.09 0.52±0.19 12.182 0.000拟杆菌门0.51±0.12 0.35±0.14 10.983 0.000变形菌门0.086±0.014 0.052±0.019 13.822 0.000放线菌门0.012±0.003 0.029±0.012 18.484 0.000瘤胃菌门0.007±0.002 0.009±0.003 1.175 0.185

2.3 孕早期粪便中肠道菌群多样性对GDM 的预测价值

孕早期粪便中肠道菌群多样性指标Ace 指数、OTUs、Chao 1 指数预测GDM 的ROC 曲线见图1，三项指标均能预测GDM 的ROC 曲线分析见表3。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

表3 孕早期粪便中肠道菌群多样性预测GDM 的ROC曲线分析Table 3 ROC curve analysis of intestinal flora diversity in feces in early pregnancy in predicting GDM

2.4 孕早期粪便中主要肠道菌群丰富度对GDM的预测价值

孕早期粪便中肠道菌群拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、放线菌门丰富度预测GDM 的ROC 曲线见图2，四项指标预测GDM 的ROC 曲线分析见表4。

表4 孕早期粪便中肠道菌群多样性预测GDM 的ROC曲线分析Table 4 ROC curve analysis of intestinal flora diversity in feces in early pregnancy in predicting GDM

图2 ROC 曲线Figure 2 ROC curve

2.5 GDM 组孕早期粪便中肠道菌群多样性与HOMA⁃IR、HOMA⁃β 的相关性

GDM 组孕早期粪便中肠道菌群多样性指标Ace 指数、OTUs、Chao 1 指数与HOMA⁃IR 呈正相关（r=0.412、0.341、0.324，P<0.05），与HOMA⁃β 呈负相关（r=-0.367、-0.409、-0.308，P<0.05）。

2.6 GDM 组孕早期粪便中主要肠道菌群丰富度与HOMA⁃IR、HOMA⁃β 的相关性

GDM 组孕早期粪便中拟杆菌门、变形菌门丰富度与HOMA⁃IR 呈正相关（r=0.294、0.311，P<0.05），与HOMA⁃β 呈负相关（r=-0.426、-0.451，P<0.05）；厚壁菌门、放线菌门丰富度与HOMA⁃IR 呈负相关（r=-0.326、-0.388，P<0.05），与HOMA⁃β 呈正相关（r=0.285、0.341，P<0.05）。

3 讨论

近些年越来越多的研究开始关注肠道菌群与代谢性疾病间的关系，2 型糖尿病及肥胖等代谢性疾病患者的肠道菌群发生改变，表现为肠道菌群多样性的增加以及部分菌群丰富度增加、部分菌群丰富度降低［3⁃4，7⁃8］。

GDM 患者的胰岛素抵抗随着妊娠的进展不断加重，在孕期与胰岛素敏感性相关的因素包括胎盘来源的多种激素、细胞因子等［9⁃11］，本研究以孕早期肠道菌群的变化为切入点，对GDM 的早期预测进行了探索，旨在发现肠道菌群用于GDM 早期预测及评估中的价值，进而为发现GDM 的预测手段、认识GDM 的发病机制提供依据。

厚壁菌门与拟杆菌门是肠道内的优势菌群，两者在能量代谢的调控中展现出不同功能，前者具有增加胰岛素敏感性、改善糖脂代谢的作用，后者则诱发胰岛素抵抗、导致糖脂代谢紊乱及肥胖［12⁃14］。既往多项学者在2 型糖尿病和肥胖患者中观察了肠道菌群的变化，本研究在GDM 患者中观察了孕早期肠道菌群的变化，所得到的结果较为一致。既往2 型糖尿病及肥胖中肠道菌群的研究主要为横断面研究，本文GDM 患者肠道菌群的研究为队列研究，队列形式为孕早期检测肠道菌群、在孕中期评估GDM，通过ROC 曲线分析该队列中GDM 的预测情况可知：孕早期肠道菌群多样性指标及丰富度指标均对孕中期发生GDM 具有预测价值。

本研究已经证实GDM 患者孕早期拟杆菌门及变形菌门的丰富度增加、厚壁菌门及放线菌门的丰富度降低，结合肠道菌群在胰岛素敏感中的调控作用进行推测，孕早期肠道菌群的变化可能在孕期影响胰岛素敏感性、造成胰岛素抵抗。为了初步验证这一推测，本研究进行了孕早期肠道菌群检测结果与孕中期OGTT 结果的相关性分析，孕中期HOMA⁃IR 的增加和HOMA⁃β 的降低反映了胰岛素抵抗程度的加重，相关性分析的结果显示：肠道菌群多样性指标Ace 指数、OTUs、Chao 1 指数及拟杆菌门、变形菌门丰富度与胰岛素抵抗程度呈正相关，厚壁菌门、放线菌门丰富度与胰岛素抵抗程度呈负相关。

综上所述，孕早期肠道菌群多样性及丰富度的变化与GDM 的发病有关，GDM 患者孕早期肠道菌群的特征为多样性及拟杆菌门丰富度的增加、厚壁菌门丰富度的降低；孕早期检测肠道菌群不仅能够预测GDM，还能评估GDM 的胰岛素抵抗程度。