姜黄素通过调控NLRP3炎症小体抑制急性脊髓损伤后的炎症反应

苏啸尘，王国强，李江波，姬 乐，李 萌，张银刚，姬文晨*

(1西安交通大学第一附属医院骨科，西安 710061；2陕西省人民医院骨科;*通讯作者,E-mail:jiwenchenbaoyan@163.com)

随着社会的不断发展，车祸及高处坠落伤等暴力因素所导致的创伤越来越多，一旦发生爆裂性脊柱骨折，往往伴有脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)，会造成严重的肢体功能障碍，对于患者远期的生活质量产生严重危害[1]。胸腰段是脊柱的一个特殊节段，占脊柱骨折的90%，容易发生骨折并造成SCI[2]。原发性损伤往往在损伤即刻发生，无法逆转；继发性损伤则是后续功能紊乱的重要原因，一般包括炎症反应、过氧化反应、自由基和细胞通道破坏等一系列级联反应，其中炎症反应被认为是重中之重，早期抑制炎症反应对于SCI后期功能的恢复至关重要[3-5]。姜黄素治疗SCI在既往研究中已经被证实具有积极的意义，具备抗氧化、抗炎症的作用[6-8]，但其抗炎的具体机制是什么，是否与调控NLRP3炎症小体有关，尚未见相关报道。基于此，本课题拟采用姜黄素治疗大鼠急性损伤，探讨其在调控NLRP3炎症小体中的作用，为临床治疗SCI提供一种参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验采用2月龄雌性SD大鼠，均为清洁级，体质量200～220 g。动物由西安交通大学医学部动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK(陕)12-018。本研究经西安交通大学医学部伦理委员会批准，批准文号：2022-117。

1.2 主要仪器与试剂

IL-1β试剂盒(Abcam公司，美国)，IL-6试剂盒(Abcam公司，美国)，NLRP3(Abcam公司，美国)，Caspase-1(Abcam公司，美国)，ASC(Abcam公司，美国)，苏木精染色液(西安三浦化学试剂有限公司，中国)，伊红染色液(武汉博士德生物工程有限公司，中国)，石蜡切片机(Leica公司，德国)。

1.3 脊髓损伤模型的建立与实验分组

按照课题组前期方法制作脊髓损伤动物模型[9,10]。根据后续实验要求，每组需存活10只大鼠，为防止术中和术后意外死亡，每组初始各使用15只大鼠。将大鼠随机分为3组，每组15只。对照组打开椎板，不做任何处理；脊髓损伤组打击造模成功，不做任何处理；姜黄素组打击造模成功后，经腹腔注射姜黄素(100 mg/kg)，连续7 d。

术前禁食6 h后，以10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后备皮消毒，以T10为中心行背部正中切口，长约2.5 cm，逐层分离肌肉及组织，充分暴露T9～T11节段，生理盐水冲洗止血，咬骨钳去除T10棘突及椎板，保留硬膜完整，充分暴露T10脊髓后，假手术组直接逐层缝合切口，其他两组则使用击打器击打T10，打击能量60 cm·g，若观察到损伤局部迅速出现充血水肿，双后肢抽搐，尾巴摆动，则造模成功。

1.4 BBB评分

术后1，2，4周进行BBB评分，评估大鼠后肢功能的恢复，分数越高说明功能恢复越好[11]。

1.5 HE染色观察炎性细胞浸润情况

术后4周，各组取3只大鼠，心脏灌注后，进行如下操作：脊髓损伤组和姜黄素组，以打击点为中心取脊髓组织2 cm，对照组取相同平面的正常脊髓组织2 cm，采用4%的多聚甲醛固定，制作蜡块后常规切片(厚度为5 μm)，完成HE染色。

1.6 ELISA检测组织炎症因子IL-1β和IL-6

术后4周，各组取3只SD大鼠,切取包括脊髓损伤处上下各2 cm的组织，用PBS在冰上匀浆，4 ℃，10 000 r/min离心30 min，随后收集上清液进行ELISA。按照ELISA试剂盒说明书检测IL-1β和IL-6。

1.7 Western blot检测NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表达

术后4周，各组取4只SD大鼠,切除包括脊髓损伤处上下各2 cm的脊髓组织，进行如下操作：RIPA裂解液提取脊髓总蛋白后进行定量，取各组等量(50 μg)总蛋白在SDS-PAGE上电泳，转移到硝酸纤维膜上后5%去脂奶粉封闭3 h，一抗NLRP3(1 ∶1 000稀释)、Caspase-1(1 ∶1 000稀释)和ASC(1 ∶500稀释)4 ℃孵育过夜，按1 ∶2 000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育，曝光洗片后，用Image Lab 8.0软件检测蛋白的相对表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 术后各组大鼠死亡率

对照组和脊髓损伤组各1只麻醉意外，脊髓损伤组1只泌尿系感染死亡，姜黄素组腹腔注射姜黄素后腹膜炎2只死亡(见表1)。由于术后护理得当，给予补液，补充能量，抗感染治疗，并辅助排便，护理泌尿系等措施，大鼠整体死亡率较低。后续实验每组需要10只SD大鼠，对照组、脊髓损伤组和姜黄素组大鼠剩余数量多于10只，故采用随机挑选法，从各组剩余大鼠内挑选10只进行实验。

表1 术后各组SD大鼠死亡率

2.2 BBB评分

术后1周和2周，脊髓损伤组和姜黄素组大鼠后肢功能BBB评分差异无统计学意义；术后4周，姜黄素组BBB评分高于脊髓损伤组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后各个时间点对照组BBB评分无统计学差异，但脊髓损伤组和姜黄素组大鼠后肢功能BBB评分显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。

与对照组相比，#P<0.05；与脊髓损伤组相比，*P<0.05图1 不同组大鼠术后4周内的运动功能评分Figure 1 BBB scores of rats within 4 weeks after operation in different groups

2.3 HE染色

术后4周，对照组脊髓组织形态正常，可见大量形态规则的神经元，而脊髓损伤组和姜黄素组脊髓形态紊乱，可见炎症细胞浸润，而且脊髓损伤组的炎症细胞数量多于姜黄素组(图2)。

图2 术后4周各组脊髓组织HE染色 (×200)Figure 2 HE staining of spinal cord tissue at 4 week after operation in each group (×200)

2.4 ELISA检测IL-1β和IL-6表达

术后4周，与对照组相比，脊髓损伤组和姜黄素组的炎症介质IL-1β和IL-6表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与脊髓损伤组相比，姜黄素组炎症介质IL-1β和IL-6表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

与对照组相比，*P<0.05；与脊髓损伤组相比，#P<0.05图3 术后4周各组脊髓组织炎症介质的表达Figure 3 Expression of inflammatory mediators in spinal cord tissue at 4 week after operation in each group

2.5 Western blot检测NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表达

术后4周，Western blot检测各组蛋白的表达，结果显示：与对照组比较，脊髓损伤组和姜黄素组的NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与脊髓损伤组比较，姜黄素组的NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表达降低，差异有统计学意义(P<0.05，见图4)。

与对照组相比，*P<0.05；与脊髓损伤组相比，#P<0.05图4 术后4周各组脊髓组织中蛋白的表达Figure 4 Protein expression in spinal cord tissue at 4 week after operation in each group

3 讨论

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)作为脊柱骨折最严重的并发症之一，致残性高，治愈率低，如果损伤平面涉及上颈椎，部分患者在损伤后短时间内死亡，给社会和家庭造成严重的经济负担[12]。目前，临床治疗SCI主要有以下几种方法：手术治疗主要机制是减除骨块对神经的压迫，恢复脊柱稳定性，防止进一步损伤；保守治疗通常使用营养神经药物甲钴胺，血管活性药物前列地尔，以及类固醇激素甲强龙改善局部微环境；康复治疗，通过理疗、针灸、电刺激等方法促进肢体功能恢复[13-15]。然而，上述方法对于SCI的治疗虽然有一定效果，但离理想状态还相差甚远，所以深入研究SCI的病理学机制，尽早给予干预，防止继发性损伤显得尤为重要。

炎症反应被认为是SCI微环境紊乱的重要原因，减轻炎症反应对于抑制细胞凋亡、维持神经元的存活有着重要意义[16]。有研究发现NLRP3炎症小体在SCI后的炎症反应中起着重要作用，SCI可以促进NLRP3、pro-Caspase-1及ASC蛋白的转录并发生寡聚化，组成为成熟的NLRP3-ASC-pro-Caspase-1蛋白复合体，即NLRP3炎症小体，进而促进炎症因子的释放，最终导致神经功能继发性损伤，所以，抑制NLRP3炎症小体的活化对于SCI的治疗至关重要[17,18]。姜黄素是姜黄植物根茎的提取物，既往应用姜黄素治疗SCI取得了一定的成果[19,20]。郝琴等[21,22]认为姜黄素可以促进SCI大鼠后肢功能的恢复，最佳腹腔注射计量为100 mg/kg，主要是通过抑制细胞凋亡和减轻炎症反应来提高神经功能。然而，姜黄素抑制炎症反应及发挥抗凋亡作用是否与调控NLRP3炎症小体有关尚未见相关报道。

为了解决这一问题及进一步探讨SCI的修复机制，我们设计完成此次课题，参照既往研究结果将姜黄素的给药浓度定为100 mg/kg，给药时间为术后连续7 d。术后4周，姜黄素组BBB评分高于脊髓损伤组，但低于对照组，这表明姜黄素组可提高SCI后动物肢体的运动能力，是一种有效治疗SCI的方法，但距离正常大鼠仍然差距较远。术后4周，相于对照组，姜黄素组的脊髓形态紊乱，炎症细胞浸润较多，炎症介质IL-1β、IL-6升高，NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达增高，但相对于脊髓损伤组，姜黄素组炎症细胞浸润减少，炎症介质表达降低，NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达降低，这就说明姜黄素可以显著抑制SCI后的炎症反应，且与调控NLRP3小体有着重要关系，因为炎症介质的降低与NLRP3相关蛋白的降低呈正相关。

与此同时，本课题研究中也发现一些问题，首先是姜黄素溶解后通过腹腔注射会导致一部分大鼠死亡，通过解剖认为腹膜炎是其死亡的重要原因，所以改进姜黄素的使用方法是未来研究的方向之一，尤其近年来纳米载体的逐步兴起，为后续研究带来新的思路，是否可以采用纳米载体携带姜黄素通过尾静脉注射，从而提高药物的起效浓度，值得进一步研究。其次是本实验在HE染色结果观察炎性细胞浸润时，只是宏观地进行了判断，只能初步确定腹腔注射姜黄素可以抑制脊髓损伤后的炎症反应，后续研究我们会对其进行定量计数，来深入探究其抑制炎症的具体机制并推进实验其他部分的进展。

综上所述，本研究发现姜黄素可能通过抑制脊髓损伤后的炎症反应，促进大鼠后肢功能的恢复，探讨其可能的作用机制，发现可能与调控NLRP3炎症小体有关，这一结果对于后期进一步研究SCI的修复机制有着重要意义。