土壤有效养分和微生物特征对短期不同放牧强度的响应

高昌宇， 齐志远， 郑 慧， 陈玺洋， 秦加敏， 郝 杰，张乃莉， 王常慧,5*， 董宽虎*

(1. 山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801； 2. 山西右玉黄土高原草地生态系统定位观测研究站， 山西 右玉 037200；3. 草地生态保护与乡土草种质创新山西省重点实验室， 山西 太谷 030801； 4. 北京林业大学森林培育与保护教育部重点实验室， 北京 100083； 5. 中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室， 北京 100093)

放牧是天然草地的主要利用方式之一，不同的放牧强度通过家畜的采食和践踏直接影响植被组成和土壤的养分状况，适度放牧有利于草地的更新和健康，维持高的生物多样性、微生物活性和地上生产力[1]。但是，大多数草地生态系统由于没有实施科学的管理，处于过度放牧造成严重退化的状态。过度放牧不仅改变草地土壤的物理结构，使得土壤容重升高，土壤通透性降低，更重要的是使得草地土壤有效养分流失，生物多样性降低导致不同程度的退化或荒漠化等[2-4]。尤其在农牧交错带，受农业和牧业的双重影响，草地属于极度脆弱的生态系统。因此，研究不同放牧强度对农牧交错带草地生态系统结构与功能的影响，为该区域草地管理和可持续发展提供科学依据是非常必要的。

虽然大量的研究报道了放牧影响土壤有效养分，但是其中的机理并不清晰。土壤微生物参与土壤养分循环的各个过程，也是土壤可利用养分不可缺少的部分，微生物通过分解动植物残体，参与生态系统的能量流动和物质循环[5-6]，对土壤养分循环产生直接的影响[7-8]。土壤微生物生物量表征土壤微生物的活性和土壤养分的有效性[9]，是表征土壤健康状态的重要指标之一[10]。已有的研究也报道了放牧对草地土壤微生物的影响，邬嘉华(2018)等[11]研究发现温带典型草原放牧对土壤真菌群落结构影响显著，而且随放牧强度的增加，真菌的丰度降低。Krone(2011)等[12]在半天然草原研究发现使用犁作为扰动源，翻土30 cm深会改变真菌群落组成。草地土壤有效养分库容易受气候变化和人为干扰的影响，因此存在显著的季节动态变化。土壤可溶性有机碳、氮是维持微生物生命和活性的重要养分，是土壤可利用养分库的重要组成部分[13-14]，土壤可溶性氮影响植被以及土壤氮储量的变化[15-16]。放牧如何影响土壤有效养分库以及影响的程度研究报道并不一致[17]，有促进[4,18]、抑制[19-20]和没有[21]显著影响。造成这些差异是因为草地类型、放牧家畜不同以及放牧强度和放牧持续时间不同。

目前，放牧对草地生态系统结构与功能影响的研究大部分集中于天然牧区草地。对于农牧交错带草地生态系统的放牧研究较少。本研究依托2016年在位于山西省右玉县境内典型农牧交错带草地生态系统建立的放牧实验平台，研究放牧处理4年后整个生长季(5—9月)的草地土壤有效养分和微生物特征，包括土壤可溶性有机碳(Soil dissolved organic carbon,DOC)、土壤可溶性氮(Soil dissolved nitrogen,DN)、土壤微生物生物量碳(Soil microbial biomass carbon,MBC)、土壤微生物生物量氮(Soil microbial biomass nitrogen,MBN)和细菌、真菌丰度的季节变化规律，并且分析了它们之间的关系，揭示短期不同放牧强度处理对我国北方农牧交错带草地生态系统土壤有效养分和土壤微生物特征的影响，为我国农牧交错区草地管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验样地位于山西省朔州市右玉县威远镇后所堡村(39°59′N，112°19′E)，海拔1 348 m。属温带季风性气候，四季分明，年均温4.7℃，其中最低月(1月)均温为-14.0℃，最高月(7月)均温为20.5℃。无霜期为5月初至9月初，约120 d。全年太阳总辐射量约598 kJ·cm-2，年日照2 600～2 700 h；年平均降水量约435 mm，集中于6—9月[22-24]。土壤为栗钙土，优势种为赖草(Leymussecalinus(Georgi) Tzvel.)，其他伴生种有羊草(Leymuschinensis(Trin.) Tzvel.)、碱蒿(ArtemisiaanethifoliaWeb. ex Stechm.)、碱地风毛菊(Saussureajaponica(Thunb.) DC.)、蒲公英、(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)、鹅绒委陵菜(PotentillaanserinaL.)、车前(PlantagoasiaticaL.)等[22-23]。

2020年生长季(5—9月)总降水量为426.6 mm，主要集中在7月和8月，分别为226.2 mm和93.2 mm，生长季平均气温为16.4℃，7月最高，其均温为19.2℃(图1)。

图1 2020年生长季(5—9月)日均温和日降水量Fig.1 Average daily temperature and precipitation in the 2020 growing season (May-September)

1.2 试验设计

放牧平台建立于2016年，隶属于山西右玉黄土高原草地生态系统国家定位观测研究站，实验采取随机区组设计，设置不放牧(UG)、轻度放牧(LG，2.35羊单位·hm-2·生长季-1)、中度放牧(MG，4.80羊单位·hm-2·生长季-1)和重度放牧(HG，7.85羊单位·hm-2·生长季-1)4个放牧强度，每个放牧强度4个重复。试验小区之间用铁丝网围栏分隔，小区面积0.2 hm2，每年的6月1日，按照不同放牧强度将体重和年龄一致的绵羊放置在处理小区，一直到9月30日生长季结束，放牧时间为4个月。

1.3 试验测定指标及方法

在2020年5—10月的月初，使用直径3 cm的土钻取表层0～10 cm的土壤，每个放牧区用随机取样法取5个样品，混合后过2 mm筛，除去粗根及石砾。空气温度和降雨量取自放牧小区附近的小型气象站(HOBO U30-NRC，美国，Onset)。土壤温度利用数字式地温计(M-SP-E-17，北京)测定；土壤含水量利用TDR-300(Spectrum Technologies，Plainfield，USA)测定。采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法，测定DOC和DN，MBC和MBN，其中MBC和MBN分别为熏蒸浸提液与未熏蒸浸提液中碳氮含量的差值除以转换系数0.45[25]、0.54[26]得到(总有机碳分析仪，Elementar vario，德国，TOC)。土壤DNA提取采用Fast DNA ® SPIN Kit for Soil(土壤基因组DNA提取试剂盒)，定量PCR仪器(博日LineGene9600plus型荧光定量PCR仪)测定细菌和真菌的丰富度。提取的DNA样品保存在-80℃用于PCR扩增，其中PCR引物(PAGE纯化)由生工生物工程有限公司提供，反应体系由5 μLEx Taq buffer,4 μLdNTP Mix,0.5 μLEx Taq,1 μLPrimer F,1 μLPrimer R,1 μLTemplate,12.5 μLddH2O组成，反应条件如表1所示。标准曲线通过10倍梯度稀释构建好的各质粒获得，16S基因的R2为0.9997，扩增效率为97.99%，ITS基因的R2为1.0000，扩增效率为100.99%。

表1 反应条件Table 1 Reaction conditions

1.4 数据分析

分别对DOC，DN，MBC，MBN和细菌、真菌的丰度进行单因素方差分析和多重比较(SPSS 22.0，LSD，P<0.05)。通过重复测量方差分析法，分析不同放牧强度下采样时间对土壤TC，TN，DOC，DN，MBC，MBN,细菌和真菌丰度的影响，利用Origin 2021软件作柱状图以及相关系数矩阵图。

2 结果与分析

2.1 不同放牧强度对土壤温度和土壤含水量的影响

土壤温度和土壤湿度具有明显的季节动态变化(图2)，放牧提高了生长季的土壤温度和土壤含水量。重度放牧的土壤温度和含水量的生长季均值都显著高于不放牧处理(图2，P<0.05)。

图2 2020年生长季(5—9月)放牧地土壤温度和土壤湿度Fig.2 Soil temperature and soil moisture of grazing land during the 2020 growing season (May—September)注：UG为不放牧，LG为轻度放牧，MG为中度放牧，HG为重度放牧。不同小写字母表示同一月份不同放牧强度之间差异显著(P<0.05)Note:UG means no grazing,LG means light grazing,MG means moderate grazing,HG means heavy grazing. Different lowercase letters indicate the significant difference between different grazing intensities in the same month at the 0.05 level

2.2 不同放牧强度对土壤MBC，MBN含量及MBC∶MBN的影响

土壤MBC和MBN存在明显的季节动态，并且变化趋势一致(图3)。在不放牧小区，土壤MBC在6月显著高于7月(图3，P<0.05)；MBN和MBC∶MBN在月份之间无显著差异(图3)。在轻度放牧处理下，土壤MBC∶MBN在6月显著增加，在10月显著降低(图3，P<0.05)。在中度和重度放牧处理下，土壤MBC在6月显著增加(图3，P<0.05)；土壤MBN在7月显著降低(图3，P<0.05)。

同一月份土壤MBC，MBN和MBC∶MBN在不同放牧强度之间无显著差异(图3)，8月份土壤MBN在中度放牧处理显著低于轻度和重度放牧处理(图3，P<0.05)。

图3 不同放牧强度下草地土壤MBC、MBN和MBC∶MBN含量Fig.3 Grassland soil MBC,MBN and MBC∶MBN content under different grazing intensities注：UG为不放牧，LG为轻度放牧，MG为中度放牧，HG为重度放牧。不同小写字母表示同一月份不同放牧强度之间的差异显著性；不同大写字母表示同一放牧强度不同月份之间的差异显著性。下同Note:UG means no grazing,LG means light grazing,MG means moderate grazing,HG means heavy grazing. Different lowercase letters indicate the significance of the difference between different grazing intensities in the same month;different capital letters indicate the significance of the difference between different months of the same grazing intensity. The same as below

2.3 不同放牧强度对土壤DOC，DN含量及DOC∶DN的影响

土壤DOC和DN存在明显的季节动态(图4)。在不放牧处理下，土壤DN含量在5月和6月显著高于7月、9月和10月(图4，P<0.05)；DOC∶DN在9月显著高于5月和8月(图4，P<0.05)。在轻度、中度和重度放牧处理下，土壤DOC和DN含量在9月均显著低于其它月份(图4，P<0.05)。

同一月份草地土壤DOC，DN含量和DOC∶DN在不同放牧强度之间差异不显著(图4)。与不放牧相比，土壤DOC含量在9月轻度放牧处理下显著降低(图4，P<0.05)；土壤DOC和DN含量在9月表现出较低值，DOC∶DN有升高的趋势，但差异不显著(图4)。

图4 不同放牧强度下草地土壤DOC、DN和DOC∶DN含量Fig.4 Grassland soil DOC,DN and DOC∶DN content under different grazing intensities

不同放牧强度处理下，土壤MBC∶DOC在不同的月份间没有显著差异(图5)，但是7月表现出下降的趋势(图5)，且MBC∶DOC与土壤水分含量的变化趋势相同(图3)，土壤MBN∶DN在10月份最高。

图5 不同放牧强度下草地土壤MBC∶DOC和MBN∶DN含量Fig.5 Grassland soil MBC∶DOC and MBN∶DN content under different grazing intensities

2.4 不同放牧强度对土壤细菌和真菌丰度的影响

土壤细菌和真菌的丰度存在显著的季节动态变化(图6)，均呈现出先上升再下降最后上升的趋势(图6)，而细菌与真菌的比值呈现先上升后下降的趋势。在不放牧处理下，细菌和真菌丰度在9月均显著高于5月和8月(图6，P<0.05)；在轻度、中度放牧处理下，真菌丰度在9月显著增加(图6，P<0.05)。

与不放牧小区相比，2020年5—9月细菌与真菌丰度均值，轻度放牧处理均显著降低(图6，P<0.05)。

图6 不同放牧强度下草地土壤细菌丰度、真菌丰度和细菌∶真菌Fig.6 Grassland soil bacterial abundance and fungal abundance and bacteria/fungi under different grazing intensities

2.5 不同放牧强度土壤养分及细菌和真菌丰度的关系

由表2可知，月份显著影响土壤微生物特征(P<0.05)，放牧强度处理对土壤微生物特征没有显著影响，月份和放牧强度处理的交互作用对土壤养分及微生物特征影响不显著。

表2 土壤微生物特征重复测量方差分析结果Table 2 Analysis of variance results of repeated measurement of soil microbial characteristics

2.6 土壤微生物特征与土壤理化性质的相关性分析

由图7所示，真菌的丰度与土壤pH值呈显著负相关(P<0.05)；细菌:真菌与土壤pH值呈显著正相关(P<0.05)；土壤DOC含量与土壤温度呈显著正相关(P<0.05)；土壤MBN含量和细菌:真菌与土壤湿度呈显著负相关(P<0.05)。

图7 8月土壤微生物特征与土壤理化性质的相关性分析Fig.7 Correlation analysis of soil microbial characteristics and soil physical and chemical properties in August注：椭圆朝右上表示正相关，朝右下表示负相关；*在置信度(双测)为0.05时，相关性是显著的Note:the ellipse facing up to the right indicates a positive correlation,and facing down to the right indicates a negative correlation;*When the confidence (double test) is 0.05,the correlation is significant

3 讨论

3.1 不同放牧强度对土壤可利用养分库和微生物特征的影响

本研究表明，4年不同强度的放牧处理没有显著影响农牧交错带草地土壤可利用养分库，但是存在显著的季节动态，说明温度和降水是影响土壤微生物活性的重要因素，从而影响可利用养分库。放牧虽然提高了土壤温度和土壤含水量，但是放牧引起土壤温度和水分的增加远远小于温度和降雨引起土壤水分变化的季节动态，因此，放牧对土壤可利用养分库和微生物特征没有通过提高土壤温度和含水量产生影响。放牧通过影响草地植物的生长和凋落物组分，影响草地生态系统微生物参与的养分循环过程[27]，同时放牧动物通过采食、践踏与粪尿归还对草地土壤养分状况产生影响[28]。我们发现，经过4年的放牧处理，生长季土壤DOC和DN含量有降低的趋势，但是差异不显著，这与阿穆拉(2011)等[29]在荒漠草原研究结果一致，随着放牧强度的增加，动物的采食和践踏行为加剧，使草地初级生产力以及凋落物累积量降低，减少进入土壤的有机物，从而影响土壤有机质含量[29]。我们还发现轻度和中度放牧使得土壤可利用养分有升高的趋势，而重度放牧处理下呈现降低趋势，已经初步证实了轻度和中度放牧有利于土壤养分的周转和微生物活动，但是需要长期实验结果进一步验证。

土壤MBC，MBN存在明显的季节变化，与高雪峰(2010)等[30]在内蒙古典型草原研究结果一致，土壤微生物生物量有较强的季节变化，且峰值出现在8月份，重度放牧降低土壤微生物生物量。华北地区四季分明，8月水热同期有利于土壤微生物的生长和繁殖。土壤MBC，MBN随放牧强度的增加有降低的趋势。这与已有研究报道的重度放牧降低土壤微生物生物量结果一致[31]，而且在内蒙古典型羊草草原和大针茅草原的长期自由放牧地也发现MBC显著下降[31]。由于我们的放牧处理只进行了4年，不同强度的放牧处理尚未对土壤可利用养分产生显著影响，短期放牧不能改变土壤总碳氮库，这可能是短期放牧处理没有引起土壤微生物特征发生显著变化的重要原因[32]。

已有研究表明，当土壤温度和含水量升高的时候，凋落物分解速率最快且微生物活性最高，所以，在土壤温度和水分含量较高的环境下，土壤微生物对营养物质的固持率也较高，5月和6月的MBC和DOC含量也呈现较高的趋势(图3，图4)。土壤水分含量是影响土壤微生物活性的重要因子，因此土壤MBC与土壤含水量有较好的相关性[33-34]。另一方面，由于放牧家畜对草地植被进行长期啃食，导致草地生态系统地上、地下生物量分配发生变化，植被更多地向地上分配，从而降低了土壤微生物量[20,35]。

3.2 放牧强度对土壤养分和微生物关系的影响。

土壤有机质在微生物的生命活动过程中是不可或缺的，且微生物在有机质分解过程中会将土壤中的有机质转化为CO2或是植物可以直接吸收利用的形态[36]，放牧直接或者间接的影响土壤微生物的数量以及微生物群落的结构组成，对土壤有机质产生影响。我们发现，与不放牧相比，放牧降低了细菌和真菌丰度，增加了细菌与真菌丰度的比值。与细菌相比，真菌的养分利用效率更高，土壤细菌与真菌的比值越小，说明有更大的固碳潜势[37]。另外在不同放牧强度处理下，细菌丰度大于真菌丰度，这与曹淑宝(2012年)等[38]在呼伦贝尔草甸草原的研究结果一致。细菌与真菌的比值呈现先上升后下降的趋势，这与李春莉(2009年)等[39]在内蒙古荒漠草原的研究结果一致。由于春夏交接之季降雨少，土壤表层的微生物在含水量较低的环境条件下活性较低，所在真菌和细菌的丰度较低(图6)；由于细菌对水分变化的敏感性高于真菌，因此生长季细菌丰度高于真菌丰度[39]。

4 结论

综上所述，短期不同放牧强度对晋北农牧交错带草地生态系统生长季土壤微生物特征(土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量碳氮比、细菌和真菌丰度)和土壤可利用养分库(可溶性有机碳、可溶性有机氮、可溶性有机碳氮比)没有显著影响，土壤可利用碳氮库及微生物群落呈现出一个较为稳定的水平，说明短期的放牧对该草地土壤养分循环过程及土壤微生物结构与功能没有产生显著影响。从短期放牧结果推断，农牧交错区草地生态系统土壤可利用养分和微生物结构与功能对放牧的响应会随着处理时间的延长而增强，未来需要继续在长时间尺度研究不同放牧强度对土壤养分及微生物的影响，从而进一步为农牧交错区草地生态系统的科学利用和适应性管理提供科学依据。