芳基烃受体AhR对CVB3诱导病毒性心肌炎小鼠心肌细胞损伤和焦亡的影响

纪新博， 顾申红， 麦华德， 符碧薇

(1.海南医学院第一附属医院全科医学科, 海南 海口 570100 2.海南医学院基础医学与生命科学学院, 海南 海口 571199)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一种由病毒感染及相关自身免疫性疾病引起的非缺血性炎症性疾病，以心肌非特异性间质性炎症为主要病变，占心肌炎的绝大多数，也是引起年轻人心力衰竭、心律失常和猝死的重要原因[1]。流行病学研究表明，VMC的发病率每年约达到1.0～2.2百万[2]。VMC通常表现为胸痛、心悸、呼吸困难，部分患者可能发展为心力衰竭，给患者和社会均带来巨大的经济负担。目前，抗病毒药物、免疫抑制剂和循环支持是VMC的主要治疗方法，但仍有许多患者在治疗后发展为心力衰竭[3]。因此，探索VMC的发病机制及其新型有效治疗方法仍是十分必要的。芳基烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一种配体激活的转录因子，该基因位于人类7p21染色体上，在人体肺、肾、肝和胸腺等各器官组织中均表达。AhR在与配体如多环和卤代芳烃及其他外源性物质相互作用后，以异二聚体形式与AHR核转运蛋白结合，成为介导外源代谢和环境反应的多功能蛋白质，在氧化应激、炎症反应、细胞生长及转移等方面均表现出不同的生物学作用，并参与调控先天性和适应性免疫反应[4,5]。但关于AhR在VMC中的功能及作用研究报道相对较少，鉴于此，本研究通过柯萨奇B3病(coxsackievirus 3，CVB3)诱导构建VMC小鼠模型，并给予AhR抑制剂CH223191进行干预，旨在探讨抑制AhR对VMC中心肌损伤的影响及其作用机制，从而为该疾病的临床治疗研究提供实验依据与理论基础。

1 材料与方法

1.1实验动物:60只健康BALB/c小鼠(购于海南药物研究所有限责任公司)，雄性，6周龄，体质量20～22g，饲养于海南医学院实验动物中心，温度设置为22～24℃，相对湿度为65%，并以12h/12h明暗周期交替。实验期间，所有小鼠均自由饮水与饮食。

1.2主要试剂与材料:AhR抑制剂CH223191购于美国Selleckchem公司，CVB3购于美国标准菌种保存中心，cTnl、TNF-α、IL-1β及IL-18 ELISA检测试剂盒购于南京凯基生物公司，HE染色试剂盒购于上海翌圣生物公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于武汉博士德生物公司，免疫组织化学染色试剂盒购于北京索莱宝生物公司，DAPI染液瑞士Roche公司，Trizol试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒和SYBR®Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂盒购于大连宝生物工程公司，DAB显色试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白测定试剂盒、PVDF膜以及ECL试剂液均购自上海碧云天生物研究所，抗体caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD及GAPDH等购于英国Abcam公司。

1.3方 法

1.3.1动物分组、造模及处理:将60只BALB/c雄性小鼠按照数字随机表法分为4组：对照组(Control)、AhR抑制剂组(AhR inhibitor)、模型组(VMC)、VMC+AhR抑制剂组(VMC+AhR inhibitor)，每组15只。模型组和VMC+AhR抑制剂组的小鼠参考文献方法[6]，通过腹腔注射0.1 mL CVB3病毒液(滴度为107 TCID50)构建心肌炎动物模型，对照组和AhR抑制剂组的小鼠同时腹腔注射等量PBS溶液。同时，AhR抑制剂组和VMC+AhR抑制剂组(VMC+AhR inhibitor)的小鼠参考文献[7]按照10 mg/kg的剂量分别腹腔注射AhR抑制剂CH223191，对照组和模型组的小鼠均腹腔注射等量PBS溶液，连续10d。

1.3.2心脏超声检测:各组小鼠给药10d后，1.5%异氟烷吸入麻醉，固定在手术台上，通过高分辨率Vevo2100小动物超声成像系统进行心脏超声检测，记录小鼠左心室射血分数(ejection fraction，EF)、缩短分数(fractional shortening，FS)、左心室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)以及左室舒张末期前壁厚度(left ventricular anterior wall during diastole，LVAWd)等心功能相关指标。

1.3.3ELISA法:各组小鼠通过心脏取血，将血液标本室温静置2h后，4℃下以4000r/min离心10min，收集上层血清，根据ELISA检测试剂盒说明书操作，制作标准曲线，测定各组小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量。

1.3.4HE染色:收集各组小鼠心脏标本，清洗干净，置于4%多聚甲醛中室温固定过夜。次日，采用梯度乙醇对组织进行脱水处理，二甲苯透明，蜡块包埋，切片机上连续切片，制备厚度约为4μm的石蜡组织切片，进行苏木精-伊红(HE)染色，切片脱蜡水化，苏木素染色5min，流水冲洗干净，伊红染液复染3min，经过脱水与透明处理后，中性树胶封片，在光学显微镜下观察心肌组织病理改变并摄取图像。

1.3.5TUNEL染色:将心肌组织石蜡切片脱蜡水化后，PBS清洗，加入100μL浓度为20μg/mL蛋白酶K工作液(不含DNase)，室温水解15min，蒸馏水冲洗，封闭液封闭10min，取新鲜配置的50μL TUNEL检测液滴加于切片上，37℃避光孵育1h。PBS清洗后，滴加DAPI染液，室温避光孵育10min，含抗荧光淬灭剂封片液封片，在荧光显微镜下观察心肌组织细胞染色情况，并摄取图像。TUNEL阳性凋亡细胞染色显示为绿色，随机选择5个视野，计数固定视野范围内总细胞数目与TUNEL阳性细胞数目，两者比值为TUNEL细胞阳性率。

1.3.6免疫组化染色检测:将心肌组织石蜡切片常规脱蜡水化，按照标准免疫组织化学进行染色。将切片置于柠檬酸盐液浸泡，高温下修复抗原。放入新鲜配置的3%过氧化氢溶液中，室温孵育10min，再置于5%山羊血清中，室温封闭30min；分别加入兔抗NLRP3多克隆抗体(1∶200)与兔抗GSDMD多克隆抗体(1∶200)，置于4℃下孵育过夜。次日，弃原液，甩干切片，加入对应二抗覆盖切片，室温继续孵育1h；采用DAB试剂在室温下显色后，苏木精复染5min，分化数秒，自来水冲洗干净，经过脱水与透明后，中性树胶封片，光学显微镜下对免疫组织化学切片摄影，阳性染色呈黄棕色至棕色，Image-Pro Plus6.0软件测定阳性染色的强度。

1.3.7实时荧光定量PCR:在无菌环境下将心肌组织剪碎，置于研钵并加入适量液氮充分研磨，取50mg研磨的粉末，利用Trizol试剂盒提取总RNA，Nano drop仪器测定RNA浓度与纯度(OD260/280在1.8～2.1之间为合格)；去除gDNA后，通过反转录实验合成cDNA，再以获得的cDNA为模板，根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书检测扩增，定量各基因的mRNA表达水平，β-actin作为内参基因。荧光定量PCR反应系统程序设置为：95℃预变性3min，1次循环；95℃变性20s，60℃退火15s，72℃延伸45s，42次循环。实验重复3次，扩增反应结束后，以2-ΔΔCt法计算各目的基因的mRNA相对表达量。见表1。

表1 各基因引物序列

1.3.8Western blot:将心肌组织置于研钵内，加入适量液氮充分研磨，添加新鲜配置的RIPA裂解液充分混匀，置于冰上裂解30 min，4℃下以12000 r/min离心20min，吸取上清，并以BCA法检测蛋白浓度；制备10%SDS-PAGE，待胶凝固后，根据蛋白浓度计算上样体积，在梳孔内加入等量蛋白样品，通过电泳分离蛋白，切割分离蛋白的凝胶，电转至PVDF膜，转膜结束后，将其置于5%脱脂奶粉中，室温封闭1h。TBST洗膜，将膜与稀释的一抗(caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD，均以1∶1000进行稀释)在4℃下共孵育过夜；次日，弃原液，TBST洗膜，加入对应稀释的二抗，室温孵育1h，TBST再次洗膜后，以ECL显色，通过凝胶成像系统拍摄蛋白条带，Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值，GAPDH作为内参蛋白，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值作为各目的蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1抑制AhR改善CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠心功能:各组小鼠心功能指标检测结果显示，与对照组比较，VMC组小鼠FS和EF显著下降(P<0.05)，LVIDd和LVAWd显著增加(P<0.05)；与VMC组比较，VMC+AhR抑制剂组小鼠FS和EF显著升高(P<0.05)，LVIDd和LVAWd显著减小(P<0.05)，见图1。

图1 各组小鼠心功能指标检测结果

2.2抑制AhR改善CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌损伤:与对照组比较，VMC组小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β以及IL-18的含量均显著上升(P<0.05)；与VMC组比较，VMC+AhR抑制剂组小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β以及IL-18的含量均显著下降(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠血清中cTnl TNF-α IL-1β和IL-18含量比较

2.3抑制AhR减轻CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌组织病变:通过HE染色观察可见，对照组和AhR抑制剂组小鼠的心肌组织结构清晰，细胞排列整齐，未见明显的损伤现象；VMC组小鼠心肌组织发生明显病变，可见组织内细胞排列紊乱，有大量炎性细胞浸润，部分血管渗出蛋白黏液；而相较于VMC组，VMC+AhR抑制剂组小鼠心肌组织内炎性细胞浸润减少，细胞排列较为整齐，病理损伤现象明显减轻，见图2。

图2 HE染色观察各组小鼠心肌组织病理学形态(×100)

2.4抑制AhR减少CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡:TUNEL染色检测各组小鼠心肌组织内心肌细胞凋亡，经分析检测结果发现，VMC组小鼠心肌组织内染色区域明显多于对照组，TUNEL阳性率显著升高(P<0.05)；而VMC+AhR抑制剂组小鼠心肌组织内染色区域明显少于VMC组，TUNEL阳性率显著降低(P<0.05)，见图3。

图3 TUNEL染色检测各组小鼠心肌组织细胞凋亡(×100)

2.5抑制AhR抑制CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌组织内NLRP3和GSDMD表达:利用免疫组织化学染色检测各组小鼠心肌组织内NLRP3和GSDMD表达，根据染色结果分析显示，与对照组比较，VMC组小鼠心肌组织内NLRP3阳性表达率和GSDMD阳性表达率均显著升高(P<0.05)；与VMC组比较，VMC+AhR抑制剂组小鼠心肌组织内NLRP3阳性表达率和GSDMD阳性表达率均显著降低(P<0.05)，见图4。

图4 免疫组织化学染色检测各组小鼠心肌组织NLRP3和GSDMD表达(×100)

2.6抑制AhR下调CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌组织内焦亡相关基因/蛋白表达:qRT-PCR测定各组小鼠心肌组织内焦亡相关基因caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD在mRNA上的表达水平，结果显示，与对照组比较，VMC组小鼠心肌组织内caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的mRNA相对表达量均显著上调(P<0.05)；与VMC组比较，VMC+AhR抑制剂组小鼠心肌组织内caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的mRNA相对表达量均显著下调(P<0.05)，见图5。

图5 qRT-PCR测定各组小鼠心肌组织内焦亡相关基因表达

Western blot检测各组小鼠心肌组织内焦亡相关蛋白caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的表达水平，结果显示，VMC组小鼠心肌组织内caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD 的蛋白相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)；而相较于VMC组，VMC+AhR抑制剂组小鼠心肌组织内caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的蛋白相对表达量均显著下调(P<0.05)，见图6。

图6 Western blot检测各组小鼠心肌组织内焦亡相关蛋白表达

3 讨 论

目前，已有多种病毒被认为是引起心肌炎的病因，虽然通过心内膜心肌活检证明了细小病毒B19(PVB19)是心肌炎中最常见的病毒，但CVB3仍是导致人类和动物病毒性心肌炎的主要病原体，大约25～27%扩张型心肌病是由CVB3引起的。与其他多种病毒的模式相同，CVB3能够通过对宿主造成直接损伤和宿主免疫系统功能异常诱导的间接损伤来引发VMC[3]。在本研究中，经过CVB3诱导的小鼠表现出FS和EF下降，LVIDd和LVAWd增加，心肌组织内炎症细胞浸润增多和心肌细胞坏死，由此表明CVB3小鼠模型构建成功。

VMC的主要特征是由病毒感染引起的心肌实质或间质的局部性或弥漫性病变。机体受到感染后，如果免疫系统无法消除病毒，可触发针对心肌的自身免疫反应，这需要激活浸润的巨噬细胞、自身反应性T细胞、细胞因子以及产生交叉反应抗体，因此，可以将VMC的发病机制视为一种炎症过程[8]。由于人类VMC的确切病理生理机制仍未完全明了，因此，该病的诊断和治疗仍然具有较大的挑战性。目前，心内膜心肌活检结合组织学、免疫学和分子学技术有助于VMC的诊断。然而，由于在VMC的早期疾病阶段仅存在少数淋巴细胞浸润位点，因此仍难以获得准确的诊断。

越来越多的研究表明，AhR是一种重要的疾病调节剂，尤其是AhR在调节免疫和炎症反应中具有关键作用。已知AhR与多种由免疫或炎症过程驱动的疾病有关，包括重度抑郁症、多发性硬化症、类风湿性关节炎、哮喘等[9,10]。作为一种高度保守的核受体，AhR可在配体结合后调节基因表达，因此，AhR影响免疫或炎症疾病的机制可概括为靶向基因表达。关于AhR在各种疾病引起的心脏功能异常中作用也已有相关报道，且多项研究表明AhR参与了心血管结构及功能异常的发病机制，例如，AhR通过增强c-Jun/HIF-1α信号传导促进血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心脏纤维化，由此表明了AhR信号通路在心脏纤维化发展中的致病作用[11]；在心肌细胞中消融AhR基因可保护雄性小鼠免受因NKX2.5单倍体不足引起的心脏功能障碍[12]。由此推测，抑制AhR可能在一些疾病中发挥组织保护作用。鉴于上述内容，本研究通过在CVB3诱导VMC小鼠模型后给予AhR抑制剂CH223191作用，检测结果显示出小鼠心功能得到恢复，心肌组织炎性细胞浸润及损伤现象得到有效缓解，这表明抑制AhR对CVB3诱导VMC小鼠心功能及心肌组织损伤起到保护作用。

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡途径，其特征是DNA裂解、细胞膜孔形成、细胞内容物释放和细胞肿胀，其发生取决于炎症因子的激活。NLRP3可以通过识别同源配体与ASC结合形成分子复合物，触发形成炎症小体以激活caspase-1，活化的caspase-1促进IL-1β和IL-18的成熟从而诱导炎症反应及caspase-1介导的细胞焦亡；GSDMD在细胞焦亡中作为效应分子，其既是caspase-1的下游分子，又是NLRP3炎性体的上游激活蛋白，此外，GSDMD也能够通过促进IL-1β分泌来诱导细胞焦亡[13,14]。本研究结果显示，在CVB3诱导VMC小鼠中使用AhR抑制剂CH223191作用后，心肌组织内NLRP3阳性表达率和GSDMD阳性表达率均降低，caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD在mRNA和蛋白上的表达水平均下调，说明心肌组织内细胞焦亡受到抑制，这一现象可能与抑制AhR后发挥的心肌保护功能相关。

综上所述，对于CVB3诱导VMC小鼠而言，通过靶向抑制AhR能够改善心功能障碍，减轻心肌损伤，并抑制心肌细胞焦亡。本研究初步明确了AhR在CVB3诱导的VMC动物模型中的作用及机制，丰富了VMC相关潜在疾病标志物和治疗靶点，但该结果能否用于临床治疗工作中，有待后续进行深入探讨。