IFN-α诱导大鼠抑郁模型行为学以及海马组织CAl区5-HTA2R表达水平变化

徐柏郁, 池红井, 刘金霞

(1.承德医学院, 河北 承德 067000 2.河北省承德市卫健委信息中心, 河北 承德 067000 3.广东省深圳市南山区妇幼保健院, 广东 深圳 518000)

干扰素-α和干扰素β常常用于抗病毒、抗肿瘤甚至多发性硬化等常见疾病，治疗效果显著，但不良反应也比较多，特别是长期应用，可导致神经精神异常，发生焦虑、抑郁甚至有自杀倾向，常常被迫停药，用药中断，影响疗效。因此，探讨IFN-α诱发抑郁症发生机制是临床亟需解决问题。本文选择IFN-α皮下注射，制备抑郁症模型，并与传统的孤养兼不可预测因素诱导大鼠抑郁症模型(CUMS)方法制备的模型进行比对，探讨干扰素诱发抑郁症发生机制和病理学基础，为临床抑郁症的防治提供一条新策略。

1 材料与方法

1.1动物分组和给药:选择健康雌性成年大鼠30只，体重(200±20)g，(8±10)周龄(河北医科大学实验动物中心)。在SPF级动物实验室适应性饲养1周。开始实验前所有大鼠测量体指数，首先经过旷场实验、糖水偏好实验结果、新环境进食抑制时间测定等行为学实验进行筛选。剔除糖水偏好率小于50%、旷场实验积分值小于30或大于120、新环境抑制进食时间积分大于1min或者小于5min大鼠。每笼3只饲养，1周内不进行任何干预。对符合上述条件的大鼠采取随机数字法分为干扰素组、模型组和正常对照组，各10只。干扰素组应用IFN-α皮下注射，剂量为36μg/kg，每周一次，给药时间12周[1]。模型组给予各种慢性不可预知温和应激(CUMS)，即孤养联合CUMS造模。以7d为1个周期，每天接受1不同种刺激，主要包括：夹尾1min，间隔10min，连续10次；禁水24h；晃尾1次/s，晃尾15min；4℃冰水游泳5min；禁食24h；昼夜颠倒12h；1mA电击足底10s，间隔1min，30次；循环往复，至第12周[2]。对照组皮下注射等体积生理盐水，方法、剂量和时间同干扰素组。

1.2行为学检测

1.2.1体重检测:给药前、给药后第4周、8周和12周不同时间点测定各组大鼠体重指数。

1.2.2旷场实验:在给药前、给药后第4周、8周和12周分别进行旷场实验测试，时间为5min[3]。

1.2.3糖水偏好实验:在给药前、给药后第4周、8周和12周，大鼠禁水24h后，分别同时给予1%蔗糖水和纯净水200mL，各一瓶，观察时间24h后，记录并按下列公式计算动物的糖水偏好率。糖水偏好率(%)=糖水消耗总量/(纯净水消耗总量+糖水消耗总量)×100%[4]。

1.2.4新环境抑制进食实验:每次测试前，禁食24h，然后在旷场中心放置少量食物。旷场上方安装视频摄像头，分别将大鼠从任意的角度放在旷场中，记录大鼠整个进食过程，特别是大鼠接近并进食第一口食物的时间[5]。分别在给药前和给药后第4周、8周和12周完成测试。

1.3脑组织标本取材:利用腹腔注射10%的水合氯醛，40mg/kg，进行大鼠麻醉，将其仰卧位固定在大鼠解剖台，剪开胸腔，心脏充分暴露后，剪开右心耳，将灌注针迅速插入并固定在左心室。0.9%灭菌盐水快速灌流约10min以上，将血液尽可能冲洗干净。检查待大鼠肝脏，发现血色褪去且发黄后，再用4%多聚甲醛溶液完成灌流和固定。注意先快速灌注2min，然后缓慢灌持续30min，停止灌注后，断头并快速剥离脑组织海马区，标记后小心放入事先存放4%多聚甲醛溶液的包埋盒内固定48h。

1.4HE染色:将上述大鼠海马区组织进行石蜡包埋，组织切片，厚度不超过5μm。经过二甲苯透明和酒精洗脱等系列步骤，苏木素-伊红染色后封片，显微镜下观察结果。

1.5硫瑾染色:上述标本经过二甲苯透明和酒精洗脱等系列步骤，采用0.2%硫瑾60℃水浴染色，持续30～60min后，封片，显微镜下观察结果。

1.6免疫组化检测大鼠海马组织5-HTA2R的变化:将大鼠海马组织在4%多聚甲醛液中固定后，制备成病理石蜡块，连续切成厚度约为4μm的组织切片，进行免疫组织化学染色。切片经二甲苯与梯度乙醇脱蜡复水，加入3% H2O2置于室温下孵育10min，然后，放入4℃枸橼酸盐缓冲液，使用微波炉通过高温完成抗原修复，待其自然冷却。然后，在切片上加入鼠抗LGR5单克隆抗体(1∶200)，在4℃下孵育过夜。第2天弃去一抗，PBS清洗后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)，室温下孵育1h，PBS冲洗，加入DAB显色液进行显色。纯净水冲洗，苏木精复染，盐酸乙醇溶液分化，再经过脱水与透明，用盖玻片和中性树胶封片。在显微镜放大400倍，光学下观察实验结果，发现胞质着色成棕黄色至褐色即为阳性细胞，随机选择镜下5个视野，记录并计算阳性细胞数占视野内所有细胞数的百分比。

2 结 果

2.1两组大鼠体重和行为学情况:随着喂养时间的延长，对照组大鼠体重逐渐增加；糖盐水偏好实验、旷场试验以及新环境抑制进食时间无明显改变，各时间点比较，无统计学差异(P>0.05)；模型组和干扰素组，随着干预措施持续时间延长，大鼠体重、糖水偏爱性实验以及旷场实验评分积分逐渐减少，新环境抑制进食时间逐渐延长，有统计学差异(P<0.05)；与对照组比较，干扰素组和模型组在大鼠体重和各项行为学实验积分等有统计学差异(P<0.05)；与模型组比较，干扰素组新环境抑制进食时间逐渐延长更显著，有统计学差异(P<0.05)，但大鼠体重变化、旷场试验积分以及糖水偏爱性实验结果无统计学差异(P<0.05)，见图1。

图1 各组大鼠体重和行为学变化

2.2两组大鼠大脑海马组织形态学变化

2.2.1HE染色:正常组大鼠海马细胞数量多，密度较大，细胞层数多，排列较整齐和紧密，细胞结构完整，胞浆饱满，核仁清晰可见。模型组有明显损伤征象，其细胞数量减少，细胞间隙变大，细胞层数少，稀疏且排列紊乱和结构不完整，多呈萎缩状态，部分细胞出现空泡化，细胞核变小、固缩，少数细胞有核肿胀、淡染、碎裂，甚至脱失，呈现出嗜酸性染色；干扰素组域模型组类似，见图2。

图2 大鼠海马组织HE染色结果

2.2.2硫瑾染色:硫瑾染色后，观察海马CAl区迟发性神经元存活情况，其中核大而圆且核仁明显者为存活神经元。在光学显微镜下，海马CAl区组织学改变正常组无神经元死亡，核仁清晰可见，排列整齐；模型组神经元散在排列，细胞边界不清，核仁淡染，活细胞数量减少，干扰素组的变化较模型组更显著，见图3。

图3 大鼠海马组织硫瑾染色

2.3两组大鼠海马组织5-HTA2R表达情况:免疫组织化学检测发现，5-HTA2R阳性细胞主要集中在海马CAl区。5-HTA2R阳性表达部位细胞质，胞核为阴性。与正常组比较，干扰素组海马CAl区5-HTA2R阳性表达的神经元减少，光密度减低，差异有显著性(71.6%vs56.3%,χ2=4.85 P<0.05)，与模型对照组比较，海马CAl区5-HTA2R阳性表达的神经元略有减少，但无统计学差异(52.6%vs56.3%,χ2=0.32 P>0.05)，见图4。

图4 大鼠海马组织5-HTA2R免疫组化染色结果

3 讨 论

在临床上，慢性病毒性肝炎、肿瘤以及多发性硬化等慢性病，需要长期使用干扰素，作为主要治疗手段，发挥免疫调节和抗病毒作用。然而，常常因为干扰素诱发的神经精神类不良反应，出现情绪低落、焦虑、睡眠不好、厌食、记忆力减退等抑郁样症状甚至有自杀倾向等抑郁症表现，被迫停药[6,7]。干扰素作为炎症因子，可能Th1/Th2细胞因子失衡[8]，神经内分泌异常、最终引起单胺类神经递质摄入和受体表达水平降低或敏感性降低[9]，出现抑郁症状，单胺类神经递质摄入和受体表达水平降低或敏感性降低是抑郁症发病主要机制[10]。本文通过检测干扰素导致抑郁症大鼠行为学和A1区形态学以及单胺类递质受体表达水平的免疫组织化学指标，并与传统抑郁症模型，即孤养兼不可预测因素诱导大鼠抑郁症模型(CUMS)进行对照研究，发现两种方法制备的大鼠抑郁症模型在大鼠体重变化、旷场实验积分、糖盐水实验和新环境抑制进食时间等行为学指标以及海马A1区组织学变化就有一致性，且与正常对照组比较，海马CAl区5-HTA2R受体表达水平均出现显著降低，二者之间没有统计学差异。因此，利用干扰素皮下注射导致抑郁症，能够成为抑郁症模型制备的新策略，并为抑郁症在炎症、内分泌和神经递质之间的相互关系的研究提供理论指导。