携带TSP-1的脐带间充质干细胞来源外泌体对视网膜静脉阻塞大鼠视网膜变性的保护作用

李 霞， 张茂菊

(湖北省恩施市恩施州中心医院眼科中心， 湖北 恩施 445000)

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是视网膜静脉系统充血扩张的血管性疾病，也是导致视力丧失和视力障碍的常见眼科疾病。由于静脉血流速度缓慢，其严重程度虽不如动脉闭塞严重，但静脉闭塞潜伏期较长，起病缓慢且病程长，病情十分顽固[1]。RVO与高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、高胆固醇等全身性疾病密切相关[2]。此外，RVO的发病率与年龄密切相关，其发病率随着年龄的增长而增加，现已成为仅次于糖尿病视网膜病变的第二大致盲性眼底病。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)因其多向分化能力，现已被公认为是治疗多种疾病的有力工具，临床应用非常广泛。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSC)作为MSC的一种，不仅具有MSC的所有生物学特性，而且还表现出良好的增殖分化潜能和低免疫原性，而且可以通过非侵入性的方式获得[3]。目前研究表明，MSC的大部分治疗益处来自旁分泌释放的可溶性因子[4]。外泌体是从细胞向胞外分泌的膜质纳米囊泡，直径大小在10～100nm之间，包含蛋白质、mRNA和miRNA等分子，可作为细胞间通讯的调节剂，将多种特异成分转运到靶细胞。血小板反应素-1(thrombospondin-1，TSP-1)是一种细胞外基质蛋白，可与多种配体相互作用，包括细胞受体、生长因子、细胞因子和蛋白酶，以调节各种生理和病理过程，现已表明TSP-1介导免疫调节、炎症反应和伤口愈合的功能，此外，还能够抑制新生血管的生成[5,6]。本研究通过从携带TSP-1的hUCMSC中分离出外泌体，并将其应用于RVO大鼠模型治疗中，观察这一来源的外泌体对RVO病变的影响，以期为RVO的治疗提供新方案。

1 材料与方法

1.1实验动物：SPF级雄性SD大鼠，6月龄，体重400～500g，由湖北省实验动物研究中心提供。适应性饲养1周后开始实验。饲养温度为22～24℃、相对湿度为(50±5)%，每日光照/黑暗交替12h，环境经严格灭菌处理，期间自由饮水饮食。本研究获得我院伦理委员会审批通过。

1.2主要材料与试剂:hUCMSC(上海弘顺生物)，胰蛋白酶、胎牛血清和α-MEM完全培养基(美国Gibco)，嘌呤霉素(德国Merck)，Trizol试剂盒(美国Invitrogen)，SensiFast cDNA Synthesis试剂盒和SensiFast SYBR Green Hi-ROX试剂盒(美国Bioline)，BCA蛋白测定试剂盒、PVDF膜和ECL化学发光液(上海碧云天)，Exosomes提取试剂盒(上海贝博生物)，孟加拉红和HE染色试剂盒(北京百奥莱博)，复方托吡卡胺(日本参天制药株式会社)，爱尔凯因(美国Alcon-Couvreur)，迪可罗眼膏(沈阳兴齐制药)，荧光素钠溶液(美国Alcon公司)。抗体CD9、CD63、Alix、HIF-1α、VEGF、VCAM-1、GAPDH以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(英国Abcam公司)，慢病毒载体构建、包装、滴度测定以及基因引物序列合成交由上海生工生物公司完成。

1.3方 法

1.3.1细胞分组与转染:将hUCMSC复苏，接种在培养瓶内，添加含10%胎牛血清的α-MEM完全培养基培养，待细胞融合度达到80%时，0.125%胰蛋白酶室温消化并传代。取培养至第三代的hUCMSC接种于培养瓶，使用含TSP-1基因序列-绿色荧光蛋白标记的慢病毒悬液或阴性对照-绿色荧光蛋白标记的慢病毒悬液感染hUCMSC，分别记为NC-hUCMSC组和TSP-1-hUCMSC组，同时加入感染增强液，混合均匀，病毒复感染指数MOI=10，感染24h更换含嘌呤霉素的完全培养基进行筛选，48h后经荧光显微镜下观察慢病毒载体感染后GFP的表达。同时以正常培养的hUCMSC作对照，分别采用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞内TSP-1的mRNA和蛋白水平表达情况。

1.3.2实时荧光定量PCR:在感染后hUCMSC和各组大鼠视网膜组织中加入Trizol，按说明书操作提取细胞或组织总RNA，微量分光光度计测定总RNA纯度与浓度，1.5%凝胶电泳检测RNA完整性。利用Sensi Fast c-DNA试剂盒将总RNA反转录合成cDNA，再以获得的cDNA为模板，通过荧光定量PCR仪扩增检测各基因的mRNA表达水平，参照SensiFast SYBR Green Hi-ROX试剂盒说明书进行，扩增程序设置为： 95 ℃ 2min； 95 ℃ 5s和60℃ 10s，共40个循环。实验重复3次，以GAPDH作为内参基因，2-ΔΔCt法计算各目的基因表达量。Primer premier 5.0设计各基因引物序列，详见表1。

表1 各基因引物序列

1.3.3Western blot:使用RIPA裂解液提取感染后hUCMSC、外泌体以及各组大鼠视网膜组织的总蛋白，添加试剂液后置于冰上裂解40min，以12000 r/min离心30min，取上清，BCA法定量蛋白。制备10%SDS-PAGE凝胶，取提取的各组蛋白样品等量上样，进行电泳分离蛋白，将分离后的蛋白切胶后电转至PVDF膜，将膜在5%脱脂奶粉中室温封闭1h，加入稀释后的各一抗，4℃孵育过夜；次日，弃去原液，TBST充分洗膜，加入稀释后的对应二抗，室温孵育1h，TBST洗膜，利用ECL试剂显影，凝胶系统成像，Image Pro-Plus软件分析各蛋白条带灰度值，以GAPDH作为内参蛋白。

1.3.4外泌体的提取与鉴定:收集感染的hUCMSC细胞培养上清液，将上清液置于4℃低温离心机中以3,000g离心15min，弃沉淀，转移上清液至新离心管内，在4℃低温离心机中以10,000g离心20min，弃沉淀，收集上清并转移至新离心管，加入外泌体提取试剂液A，上下颠倒混合均匀，4℃静置12h。将混合液在4℃低温离心机中以10,000g离心60min，移除上清液，收集沉淀，加入保存液试剂B重悬沉淀，保存样品于-80℃冰箱。制备样品，通过透射电子显微镜观察形态，纳米粒子跟踪分析法测定粒度直径，Western blot检测外泌体的标志蛋白CD9、CD63及Alix表达情况。

1.3.5动物模型制备[7]与分组处理:将SD大鼠通过腹腔注射10g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，全身消毒，右眼滴复方托吡卡胺散瞳10min，爱尔凯因滴眼麻醉眼表，经尾静脉缓慢注入0.25mL的5%孟加拉红(50mg/kg)。给药5min后，大鼠角膜上安置滴加迪可罗眼膏的三面镜，选择伴行动脉距离较远的静脉，从静脉血管远端开始，采用波长532nm的眼底激光仪进行激光照射，每只眼间隔选3支静脉血管建立RVO模型，激光功率为60mW，光斑直径60μm，激光照射时间0.4s。血管变细后，增加参数照射近端血管，激光功率改为80mW，光斑直径100μm，激光照射时间0.5s，观察血流完全中断，形成1个视盘直径左右的血栓或阻塞，每支血管平均照射25点。建立大鼠RVO模型后，避光12h。造模的大鼠随机分为模型组、hUCMSC-Exo组、TSP-1-hUCMSC-Exo组，每组10只，另取10只健康大鼠作为对照组，hUCMSC-Exo组结膜下注射100μL hUCMSC的外泌体，TSP-1-hUCMSC-Exo组注射100 μL含TSP-1慢病毒感染的hUCMSC的外泌体，同时，对照组和模型组注射等体积的磷酸盐缓冲液。

1.3.6眼底成像观察:RVO模型建立后1d、7d、14d、21d，麻醉对照组和模型组的大鼠，以复方托吡卡胺滴眼散瞳，使用动物Micron III眼内成像系统拍摄眼底图像，观察眼底变化情况，判断造模结果。

1.3.7眼底血管荧光造影:在21d后，将各组大鼠麻醉，以复方托吡卡胺滴眼散瞳，腹腔注射100μL荧光素钠溶液(0.5mg/L)，注射5min后，立即进行观察、拍照，检测视网膜内血管变化情况。

1.3.8HE染色:眼底成像和血管荧光造影结束后，处死各组大鼠并取其视网膜组织，清洗干净，置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，利用切片机连续切片，制备厚度为5μm的组织切片。切片经脱蜡水化处理后，放入苏木素溶液中染色5min，流水冲洗，盐酸-乙醇分化数秒，伊红染液浸泡复染3min，常规脱水与透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察视网膜结构变化，并拍照。

2 结 果

2.1慢病毒感染hUCMSC效率检测:通过荧光倒置显微镜观察到转染慢病毒的NC-hUCMSC组和TSP-1-hUCMSC组细胞内出现大量绿色荧光，转染效率均达到85%以上，见图1A。实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示，与hUCMSC组和NC-hUCMSC组比较，TSP-1-hUCMSC组的hUCMSC中TSP-1 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)，见图1B、1C。

图1 慢病毒感染hUCMSC效率

2.2外泌体鉴定:透射电镜观察到分离的颗粒物为球状，呈典型的膜性小囊泡，粒度直径大约分布在100nm，见图2A与图2B。此外，Western blot检测到细胞外囊泡标志蛋白CD9、CD63及Alix均高表达，以上结果表明成功分离到外泌体。

图2 外泌体鉴定

2.3RVO模型判定:眼底图像显示，对照组大鼠在1、7、14和21d时，视网膜均表现出正常外观，未见异常现象；模型组大鼠在造模1d后，出现白色闭塞血管，以及白色缺血性斑块，在7d白色闭塞血管十分明显，缺血性斑块数量较多，在14d和21d表现为血管闭塞略有减轻，仍可见缺血性斑块，见图3，表明RVO大鼠模型构建成功。

图3 造模后大鼠眼底图像变化

2.4眼底血管荧光造影观察结果:FFA结果显示，对照组视网膜血管呈放射状，静脉管径均匀，充盈良好，未见荧光渗漏；模型组视网膜血管可见阻塞的静脉迂曲扩张，粗细不均，血管壁荧光着染、渗出；hUCMSC-Exo组视网膜血管壁有少量荧光着染，可见血管再通；TSP-1-hUCMSC-Exo组视网膜视网膜血管未见明显异常和荧光渗漏的现象，见图4。

图4 各组大鼠FFA图像

2.5视网膜组织病理学形态染色结果:经过观察HE染色结果可见，对照组视网膜组织结构完整，未见病理学损伤；模型组视网膜组织结构明显受损，内界膜和内核层均被内层渗出的浆液分离，视网膜色素上皮细胞遭到破坏，视网膜厚度不均；相较于模型组，hUCMSC-Exo组和TSP-1-hUCMSC-Exo组的视网膜结构损伤现象均有所减轻，其中，TSP-1-hUCMSC-Exo组改善现象更加明显，各层结构较为清晰，见图5。

图5 各组大鼠视网膜组织HE染色(×100)

2.6视网膜组织中HIF-1α、VEGF与VCAM-1表达的测定结果:实时荧光定量PCR和Western blot实验检测结果显示，与对照组比较，模型组视网膜组织中HIF-1α、VEGF与VCAM-1的mRNA和蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，hUCMSC-Exo组和TSP-1-hUCMSC-Exo组的HIF-1α、VEGF、VCAM-1 mRNA和蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)；同时，TSP-1-hUCMSC-Exo组的HIF-1α、VEGF、VCAM-1 mRNA和蛋白相对表达量均显著低于hUCMSC-Exo组(P<0.05)，见图6与图7。

图6 实时荧光定量PCR检测视网膜组织中HIF-1α、VEGF与VCAM-1的mRNA表达水平

图7 Western blot检测视网膜组织中HIF-1α、VEGF与VCAM-1的蛋白表达水平

3 讨 论

RVO通常发生于老年人、高血压患者以及心血管疾病患者中，作为第二大常见的视网膜血管疾病，RVO可引起视网膜毛细血管失代偿，甚至无痛性完全失明[2]。然而，其发病机制仍未完全阐明，目前，一些针对血栓形成的治疗方法，如等容血液稀释疗法、抗血小板药物、低分子量肝素和纤维蛋白溶解等在RVO治疗中获得了良好结果[8]。然而，这些方法或药物并不是完全有效的，需要通过对RVO的病因和病理机制进行透彻了解，制定新的治疗方案以实现理想的治疗目标。

越来越多的研究表明，MSC来源的外泌体作为一种新的细胞间通讯机制在各种疾病治疗中具有较大潜力，外泌体可以通过多种机制被吸收，包括膜融合、内吞作用和与细胞表面受体的结合等，从而改变靶细胞的生物行为，成为了许多疾病治疗的新途径[9]。例如，Zhang等[10]报道表明hUCMSC来源的外泌体通过调控Wnt-4信号通路在皮肤伤口愈合中发挥积极作用；Li等[11]通过将hUCMSC来源的外泌体用于治疗四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化中，发现hUCMSC来源的外泌体通过灭活TGF-β1/Smad途径来抑制肝细胞上皮间质转化，改善肝损伤以及肝纤维化。此外，外泌体已成为新型纳米蛋白质药物的递送载体，可通过加载药物或遗传因子发挥相应作用，内源性负载是目前常用的方式之一，即在供体细胞上经基因修饰将基因产物加至外泌体中从而进行靶向传送。在本研究中，通过慢病毒转染法在hUCMSC中携带TSP-1后再分离外泌体，进而探究经TSP-1修饰的hUCMSC来源的外泌体对RVO大鼠的作用情况。

TSP-1作为细胞外基质蛋白家族成员之一，在一系列组织中表达，包括角膜、晶状体、视网膜色素上皮等，通过与多种细胞受体相互作用来调节细胞功能，并介导TGF-β相关的免疫调节和伤口愈合功能[12]。研究表明，TSP-1在多种眼科疾病中发挥作用，例如，Tan等[13]通过重组TSP-1滴眼对干眼病C57BL/6小鼠进行局部治疗，发现应用重组TSP-1可减少角膜DC成熟，降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-23和IL-17A的表达，改善干眼症小鼠的疾病严重程度；Blanco-Mezquita等[14]通过对野生型和TSP-1缺陷的两种小鼠创建全层穿透角膜切口，发现TSP-1缺陷小鼠的伤口表现出慢性水肿和持续性伤口裂开，由此推测，TSP-1的缺失会导致角膜伤口炎症反应延长和伤口愈合延迟。在本研究中，经过使用携带TSP-1的hUCMSC来源的外泌体治疗RVO大鼠后，观察结果显示RVO大鼠视网膜血管荧光渗漏现象明显减少甚至消失，视网膜组织形态趋于正常，这表明携带TSP-1的hUCMSC来源的外泌体对RVO大鼠视网膜损伤变性具有良好的治疗效果。

此外，TSP-1能够以多种方式抑制血管形成与生长，包括拮抗VEGF、诱导血管内皮细胞凋亡以及调节内皮细胞增殖、迁移。其中，TSP-1通过直接与VEGF结合或抑制基质金属蛋白酶活性来限制VEGF从细胞外基质中的释放，其还能够通过阻断VEGF信号转导来抑制VEGF受体2的磷酸化，进而起到抑制VEGF活性的作用。可见，TSP-1是一种有效的新生血管形成的内源性蛋白抑制剂。在RVO中，VEGF是导致该疾病发生的一个关键因子，能够通过促进VCAM-1的高表达来介导血管内皮细胞与白细胞、中性粒细胞之间的粘附结合作用，造成血液流动受阻，加重视网膜的缺氧缺血进而造成组织损伤。而当缺氧发生时，HIF-1α的进一步激活又促进了VEGF和VCAM-1的释放，由此形成了一个恶性循环网络。在本研究中，RVO大鼠视网膜组织内HIF-1α、VEGF和VCAM-1的表达水平异常升高，经携带TSP-1的hUCMSC来源的外泌体治疗RVO大鼠后，视网膜组织内HIF-1α、VEGF以及VCAM-1的表达水平均明显下调，由此推测，该治疗作用可能与下调HIF-1α、VEGF和VCAM-1的表达相关。

综上所述，经过携带TSP-1的hUCMSC来源外泌体治疗RVO大鼠模型后，改善了视网膜微循环，缓解RVO造成的视网膜血管渗漏及组织变性损伤，这一作用可能与抑制HIF-1α、VEGF以及VCAM-1的表达相关。