大黄免煎颗粒对α-萘异硫氰酸酯诱导的肝内胆汁淤积大鼠氧化应激损伤的修复及核因子κB通路的调节作用研究Δ

张 英，侯伟娜，孙 琦，张 莹，李晓景，任晓华，谢克让，安翠平

(1.石家庄市第一医院药剂科，石家庄 050011； 2.石家庄市第一医院输血科，石家庄 050011)

肝内胆汁淤积是由于机体内胆红素代谢障碍引起的一种病理生理过程，是引起肝功能损伤的一种常见致病因素[1]。核因子κB(NF-κB)信号通路是参与炎症信号转导的重要信号通路，研究结果发现，肝内胆汁淤积的疾病进展及预后与NF-κB信号通路的调节异常密切相关[2-3]。大黄来源于掌叶大黄(RheumpalmatumL.)、药用大黄(RheumoffcinaleBaill.)和唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim.ex Balf.)的干燥根和根茎，具有抗炎、抗肿瘤和调节胃肠功能紊乱等药理作用[4]。大黄对肝内胆汁淤积具有显著疗效[5-6]。大黄免煎颗粒是由大黄饮片制成的新制剂，具有与大黄饮片等效的药理活性及作用[7]。本研究探讨了大黄免煎颗粒对α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的肝内胆汁淤积大鼠氧化应激损伤的修复及NF-κB通路的调节作用，旨在为大黄免煎颗粒的药理作用研究及其对肝内胆汁淤积的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级SD大鼠60只，雄性，6～8周龄，体重180～220 g，购自河北省实验动物中心[实验动物生产许可证号：SCXK(冀)2018-004]，饲养于动物房，温度20～24 ℃，相对湿度40%～70%。

1.2 仪器

ERM3000型石蜡切片机(常州市郝思琳医用仪器有限公司)；FLUOstar OPTIMA型多功能酶标仪(香港伯齐科技有限公司)；CKX41-F32FL型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；Allegra X-30型台式离心机[贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司]；E-Gel Imager型凝胶成像仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。

1.3 药品与试剂

大黄免煎颗粒(每2.5 g相当于原药材6 g，广东一方制药有限公司，批号为091108)；ANIT(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，批号为140018)；熊去氧胆酸(德国Losan Pharma GmbH公司，规格为250 mg，批号为180915)；NF-κB p65(货号：AF0246)及p-NF-κB p65(货号：AF5875)兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，货号：A0208)和GAPDH兔单克隆抗体(货号：AF1186)，均购自碧云天生物科技有限公司；伊红染液(货号：Y13 M6C2)、苏木精染液(货号：J28N6Y6648)，均购自源叶生物科技有限公司；超敏ECL化学发光试剂盒(货号：PE0010)、RIPA蛋白裂解液(货号：R0010)，均购自北京索莱宝科技有限公司；SOD活性(WST-8法)检测试剂盒(货号：ab65354)、MDA检测试剂盒(货号：ab118970)，均购自艾博抗贸易有限公司。

1.4 肝内胆汁淤积大鼠模型的建立

将ANIT 1 g溶于色拉油50 mL中，制成质量分数为2%的ANIT。除15只大鼠作为对照组外，其余45只大鼠参照文献[8]的方法灌胃给予2% ANIT 100 mg/kg，建立肝内胆汁淤积大鼠模型，以大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)、谷酰转肽酶(GGT)、总胆红素(TBIL)和直接胆红素(DBIL)水平较对照组显著升高(P<0.05)作为造模成功标志。对照组大鼠给予色拉油。造模完成后分为模型组、大黄免煎颗粒组及阳性对照组，大黄免煎颗粒组大鼠按照4 g/kg的剂量灌胃给予大黄免煎颗粒[9]，阳性对照组大鼠灌胃给予熊去氧胆酸(100 mg/kg)[10]，对照组及模型组大鼠给予0.9%氯化钠溶液，均1日1次，连续28 d[11]。

1.5 大鼠血清指标水平的测定

每组取15只大鼠，眼眶取血后，于4 ℃冰箱静置4 h，4 ℃条件下，3 500 r/min离心(离心半径15 cm)10 min，取上清液，使用全自动生化分析仪测定丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平。

1.6 大鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平的测定

每组取6只大鼠，颈椎脱臼法处死后分离肝组织，用4 ℃预冷的0.9%氯化钠溶液对肝组织灌流清洗后，置于组织匀浆器中，加入蒸馏水研磨匀浆，4 ℃条件下，8 000 r/min离心(离心半径15 cm)10 min，取上清液，使用酶联免疫吸附试验试剂盒检测SOD活性及MDA、GSH水平。

1.7 大鼠肝组织病理学检查

取大鼠肝组织，使用4%中性甲醛固定，石蜡包埋，进行4 μm切片，依次经过脱水、透明处理后，常规苏木精-伊红染色(HE染色)，在显微镜下观察。

1.8 蛋白质印迹法检测大鼠肝组织NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白水平

每组取6只大鼠，颈椎脱臼法处死后取肝组织，匀浆器充分裂解匀浆，4 ℃条件下，12 000 r/min离心(离心半径15 cm)10 min，取上清液，使用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度；取50 μg蛋白的肝组织匀浆液，上样至聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，并转移至聚偏氟乙烯膜上，封闭液室温(25 ℃)封闭1 h，经NF-κB p65、p-NF-κB p65兔多克隆抗体及GAPDH兔单克隆抗体(1∶1 000稀释)在4 ℃条件下孵育过夜，使用含吐温的磷酸盐缓冲液清洗3次，1次5 min，室温下，使用山羊抗兔IgG抗体(1∶2 000稀释)孵育1 h，清洗3次，在凝胶成像仪拍照，应用Image J 1.8.0软件进行定量分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 四组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平比较

与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平显著升高；与模型组比较，大黄免煎颗粒组、阳性对照组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与大黄免煎颗粒组比较，阳性对照组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，GGT水平的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 四组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平比较

2.2 四组大鼠肝组织SOD活性、MDA及GSH水平比较

与对照组比较，模型组大鼠肝组织MDA、GSH水平显著升高，SOD活性显著降低；与模型组比较，大黄免煎颗粒组、阳性对照组大鼠肝组织MDA、GSH水平显著降低，SOD活性显著升高，上述差异均有统计学意义(P<0.05)；与大黄免煎颗粒组比较，阳性对照组大鼠肝组织SOD活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)，MDA、GSH水平的差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 四组大鼠肝组织SOD活性、MDA及GSH水平比较

2.3 四组大鼠肝组织病理学检查

对照组大鼠肝组织无明显病理改变，结构正常；与对照组比较，模型组大鼠汇管区胆管增生明显，上皮细胞坏死脱落，大量炎症细胞浸润，肝组织损伤严重，中心静脉充血明显，中心静脉区周围细胞坏死，有炎症细胞渗入；与模型组比较，大黄免煎颗粒组、阳性对照组大鼠肝组织病理学明显恢复，胆管扩张及增生减轻，炎症细胞浸润减少，上皮细胞脱落及坏死减轻，肝组织细胞炎症浸润减少；与大黄免煎颗粒组比较，阳性对照组大鼠肝组织胆管扩张减轻，炎症浸润略减少，见图1。

A.对照组；B.模型组；C.大黄免煎颗粒组；D.阳性对照组A. control group; B. model group; C. Dahuang granule prescription group; D. positive control group

2.4 四组大鼠肝组织NF-κB p65、p-NF-κB p65水平比较

与对照组比较，模型组大鼠肝组织NF-κB p65、p-NF-κB p65水平显著升高；与模型组比较，大黄免煎颗粒组、阳性对照组大鼠肝组织NF-κB p65、p-NF-κB p65水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与大黄免煎颗粒组比较，阳性对照组大鼠肝组织NF-κB p65、p-NF-κB p65水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05;与大黄免煎颗粒组比较，△P<0.05Note: vs. the control group, *P<0.05; vs. the model group, #P<0.05; vs. the Dahuang granule prescription group, △P<0.05

3 讨论

肝内胆汁淤积是由于胆汁分泌及排泄障碍引起的肝脏及体循环胆红素等胆汁成分的过度堆积，进而引起的肝细胞损伤及肝功能障碍，长期持续的胆汁淤积会诱导肝组织发生纤维化甚至进展为肝硬化等严重疾病，目前临床上常使用熊去氧胆酸等利胆药进行治疗，故本研究使用熊去氧胆酸作为阳性对照药[12]。ANTI诱导的肝内胆汁淤积是目前实验中建立肝内胆汁淤积动物模型的一种常用方法。

大黄为常用的中药材，中医学认为大黄具有泻热通肠、凉血解毒和逐瘀通经等作用。现代医学研究结果发现，大黄能促进肝内胆汁淤积大鼠胆汁的排泄，修复肝损伤[13]；陈鹏等[5]指出，大黄可以缓解肝内胆汁淤积所致大鼠肝损伤，且效果优于地塞米松及熊去氧胆酸；刘萍等[6]的研究结果表明，大黄能够通过促进大鼠胃肠消化间期移行性复合肌电活动，进而促进胆汁淤积大鼠的胆汁排泄。免煎颗粒是由中药材饮片经过加工、提取等工艺制得的新型制剂，已有研究结果证实其与传统药材饮片药效学等同，且具有方便、安全的优势，在临床应用中受到广泛认可[14]。

ALT、AST、ALP和GGT是临床常用的反映肝功能的直接指标，其水平升高提示肝功能降低及肝细胞损伤[15]；TBIL、DBIL是体现体内胆红素水平及代谢的指标，其水平升高提示体内胆汁排泄障碍[16]；SOD、MDA及GSH是机体氧化应激及自我修复的常用指标，SOD活性降低、MDA和GSH水平升高均提示体内存在一定程度的氧化应激损伤[17]。本研究结果表明，大黄免煎颗粒组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平降低，肝组织MDA、GSH水平降低，肝组织SOD活性升高，提示大黄免煎颗粒能够改善并修复大鼠肝细胞的损伤，促进胆汁代谢及排泄，缓解肝组织细胞氧化应激损伤。与阳性对照药熊去氧胆酸比较，大黄免煎颗粒组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平升高，但仍在正常值范围内，且GGT水平与阳性对照组相当，提示大黄免煎颗粒具有显著的肝功能恢复作用；同时，与熊去氧胆酸组比较，大黄免煎颗粒能够显著提高大鼠肝组织SOD活性，提示大黄免煎颗粒较熊去氧胆酸能够更显著修复肝细胞氧化损伤。

NF-κB信号通路是肝脏氧化应激损伤及炎症信号传导的关键通路之一。近年来的研究结果发现，肝内胆汁淤积引起的肝细胞损伤与NF-κB信号通路改变相关，抑制NF-κB相关蛋白的过表达，能够减轻肝内胆汁淤积大鼠肝脏炎症损伤，并能够修复大鼠胃肠道黏膜[18-19]。本研究结果表明，大黄免煎颗粒组大鼠肝组织NF-κB p65及p-NF-κB p65水平降低，组织病理学显著改善，提示大黄免煎颗粒能够通过调节肝组织细胞NF-κB信号通路，促进肝脏组织病理学的恢复，改善肝内胆汁淤积大鼠疾病转归及预后。同时，与阳性对照药熊去氧胆酸组比较，大黄免煎颗粒组大鼠肝组织NF-κB p65、p-NF-κB p65水平降低更明显，提示大黄免煎颗粒较熊去氧胆酸具有更显著的NF-κB信号通路及蛋白抑制作用，这也提示了大黄免煎颗粒与熊去氧胆酸在作用机制上存在一定的差异。本研究证实了大黄免煎颗粒对于肝内胆汁淤积大鼠具有显著的肝功能修复作用，并能够呈剂量依赖性地显著抑制NF-κB信号通路及蛋白的磷酸化水平，进而抑制大鼠肝组织氧化应激损伤，修复肝组织细胞功能及病理学改变，为大黄免煎颗粒在肝内胆汁淤积治疗中的应用提供新的参考，并为大黄免煎颗粒的临床开发提供新的证据。

综上所述，大黄免煎颗粒能够明显修复大鼠肝功能及肝组织氧化应激损伤，改善胆汁代谢水平，其机制可能与调节NF-κB通路有关。