“血水同治”的桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症网络药理学机制研究Δ

谢 韬，杨碧蓉，何培芝，周 华

(上海中医药大学附属曙光医院妇科，上海 201203)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)指有活性的子宫内膜组织(腺体或间质)已经种植在子宫体外的疾病。临床上常表现为渐进性加重性痛经、难治性不孕且极易复发等特点，严重影响患者的身心和生殖健康[1]。中医认为，EMT的病理基础为血瘀，多因风寒侵袭、经产留瘀、素性抑郁等导致离经之血蓄积胞中，瘀阻胞脉冲任，血不归经，气血津液运行失常，导致湿瘀互阻，积结日久，形成癥瘕包块，治疗以活血化瘀为大法。桂枝茯苓丸为经典的活血化瘀、消癥散结方，被称为“消癥第一方”，首载于《金匮要略》，“妇人宿有癥病，经断未及三月……所以血不止者，其癥不去故也，当下其癥，桂枝茯苓丸主之”[2]。

网络药理学认为，药物治疗疾病是在各药物组成成分的干预下，经多靶点、多途径实现共同干预[3]。尤其在中药的药理学研究领域，网络药理学分析较为常用和典型。中药复方治疗疾病遵循整体观思想。而网络药理学具有整体性、系统性，并注重药物间相互作用，与中医药学基本特点存在一定相似之处，符合中医药对疾病本质的认识[4-5]。本研究通过网络药理学方法，探讨桂枝茯苓丸的靶点、活性成分和分子作用机制，希望进一步了解该药在EMT治疗领域的药理机制，促进临床合理用药。

1 资料与方法

1.1 活性成分及其作用靶点的筛选

通过BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)检索出桂枝茯苓丸中桂枝、茯苓、赤芍、桃仁和牡丹皮5种中药的化学成分及其相关靶点，并进行筛选，筛选标准：Score cutoff>20，AdjustedP-value<0.05。

1.2 EMT靶点的获取

在GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)中搜索关键词“endometriosis”，得到EMT相关靶点并进行记录。

1.3 关键靶点筛选及构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络

应用R软件(v4.0)将桂枝茯苓丸化学成分作用靶点和EMT相关的疾病靶点进行映射构建韦恩图。存在交集的共同靶点可能是桂枝茯苓丸中活性成分治疗EMT的关键靶点。以STRING数据库 (http://string-db.org/)作为操作平台，以共同靶蛋白为基础，确定“Homosapiens”蛋白种属，在“medium confidence”(>0.4)基础上构建PPI网络模型。

1.4 关键靶点基因功能注释和通路富集分析

筛选出的共同靶基因的基因本体(GO)以R软件(v4.0)进行功能注释，所预测化学成分靶点的富集分析在京都基因与基因组百科全书(KEGG)平台上进行操作，保留P≤0.01的结果，进行可视化处理，分析桂枝茯苓丸治疗EMT可能的生物过程和信号通路。

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸成分-靶点网络的构建

共筛选出桂枝茯苓丸5味中药51种类药成分，其中，桂枝16种，茯苓18种，赤芍8种，桃仁3种，牡丹皮6种；共涉及823个靶点。

2.2 EMT疾病靶点的筛选及共同靶点PPI网络构建

检索GeneCard、BATMAN-TCM等数据库，将获取的靶点进行“去重”操作后得到1 600个不重复的疾病靶点。利用R软件制作1 600个疾病靶点与823个桂枝茯苓丸类药成分作用靶点的韦恩图，获得疾病-类药活性成分共同靶点190个，见图1。以STRING数据库为操作平台，对上述靶点进行分析，得到PPI作用网络，见图2。

图1 中药靶点基因和疾病靶点基因的交集韦恩图

2.3 关键靶点GO生物功能注释

应用R软件中clusterProfiler包对桂枝茯苓丸成分-EMT疾病的190个共同作用靶蛋白进行GO生物功能注释，根据保留P≤0.01的结果，进行可视化分析，得到GO分析柱状图，见图3。可见，共同作用靶点主要富集在受体配体活性(receptor ligand activity)、激素活性(hormone activity)、生长因子活性(growth factor activity)、生长因子受体结合(growth factor receptor binding)、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)和细胞因子活性(cytokine activity)等55个生物过程。表明桂枝茯苓丸可能通过调节受体配体活性及生长因子受体结合等方面治疗EMT。

2.4 KEGG通路富集分析

应用R软件中clusterProfiler包对桂枝茯苓丸成分-EMT疾病的190个共同作用靶蛋白进行KEGG通路富集分析，根据保留P≤0.01的结果，可视化分析，得到KEGG通路富集气泡图，见图4。可见，共同靶点主要富集于非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)、美洲锥虫病(chagas disease)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路(MAPK signalingpathway)、细胞因子间相互作用(cytokine-cytokin-ereceptorinteraction)和内分泌抵抗(endocrine resistance)等。

2.5 “药物-成分-靶点”网络调控图

通过Cytoscape 3.2.1软件绘制桂枝茯苓丸的“药物-成分-靶点”网络调控图，见图5；网络拓扑图分析见表1。图5中，箭头代表桂枝茯苓丸中的五味中药，菱形代表五味中药所含的各种成分，椭圆形代表相关靶点。结果显示，桂枝茯苓丸通过5味中药所含的47种成分作用于190个相关靶点治疗EMT。

表1 网络拓扑图分析表

3 讨论

3.1 EMT的病机和治疗

EMT的发病机制较复杂，目前被广泛接受的是“在位内膜决定论”，即子宫在位内膜细胞通过上皮间充质转化具备了转移侵袭的能力，进而与同种细胞脱离，穿过腹水或腹腔液、腹腔细胞和腹腔外基质三道防线进入腹腔完成异种细胞间的黏附，为进一步的侵袭和病灶血管形成奠定基础[6-7]。现代医学以手术和激素类药物治疗为主，但其应用有限。近年来，中医药在缓解EMT痛经、缩小包块和促进生育方面疗效显著。

图2 桂枝茯苓丸治疗EMT的靶点基因PPI网络图

图3 GO功能富集分析柱状图

3.2 桂枝茯苓丸的效用和现代药理学探讨

“血水同治”为桂枝茯苓丸治疗EMT的典型疗效，方中桂枝为君药，味辛、甘，性温，主通脉祛瘀、助气行水；茯苓为臣药，可利腰脐间血；桃仁味甘、性平，消癥且不伤正，协同茯苓共奏利水渗湿之功；芍药柔肝调血；丹皮活血凉血消癥[8]。众多医家以该方为基础治疗EMT，获得了满意的临床疗效，至今仍被广泛应用。现代药理学研究结果证实，桂枝有抗病毒、抗菌、抗炎、抗凝、抗血小板聚集和抗过敏等疗效[9]；茯苓有抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝和利尿等功效[10]；赤芍有抗血栓、抗肿瘤、保肝和抗凝等疗效[11]；桃仁有抗氧化、抗炎、活血祛瘀和促进血流动力学改善等疗效[12]；牡丹皮能抗炎、抗菌，调节心血管系统。尽管现代药理学对桂枝茯苓丸各成分的药理作用有深入的研究，但是对于全方的药理学机制和临床治疗EMT的作用机制却少有报道[13]。

图4 KEGG通路富集分析气泡图

图5 桂枝茯苓丸“药物-成分-靶点”网络调控图

3.3 有效药物成分的机制分析

本研究中发现，在中药-成分-靶点-信号通路网络中，苯乙烯、麦角胺、间羟基肉桂酸、八仙花酸和去氢齿孔酸的自由度高。但目前仍不了解上述药物成分在EMT治疗中发挥的作用，有待深入研究。

3.4 桂枝茯苓丸治疗EMT的潜在靶点预测

在中药-成分-靶点-信号通路网络中，自由度高的靶点有CB1、CB2、ESR1和PGR1。CB1被发现主要表达于子宫、胎盘、睾丸以及中枢神经组织中[14]。CB2可表达于多种免疫细胞中。研究结果表明，2种大麻素受体均可参与EMT的细胞增殖、凋亡、黏附、侵袭和血管形成过程，进而影响EMT的发生发展[15]。大麻素受体还可调控异位子宫内膜组织的神经生长[16]。CB1和CB2在异位内膜中与磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路关系密切，可以通过抑制后者的活性起到抗细胞增殖的作用[17]。胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路可与PI3K/Akt信号通路相结合，共同参与CB激动剂甲烷甲酰胺增强子宫内膜间质细胞的迁移过程，研究检测到经甲烷甲酰胺处理后的异位内膜中N-钙黏蛋白及白细胞介素6的表达增加，提示CB1促进了异位内膜细胞的黏附、侵袭过程[18-19]。经迁移、黏附、侵袭以及心血管生成等变化后，异位子宫内膜可发展形成异位病灶。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成过程中的关键因子，大麻素受体已被证实能够在多种恶性肿瘤细胞中有效阻断VEGF通路，继而抑制肿瘤血管生成[20]。

雌激素在EMT异位病灶中的水平高于同期血清水平，始终是异位病灶微环境中发病的关键因素[21]。高雌激素水平在EMT中发挥促进病灶细胞增殖、促进异位内膜细胞上皮间质转化、促血管形成以及促进炎症反应发生等作用[22]。因此，减少雌激素的合成对于EMT的治疗具有重要作用。雌激素受体(ER)β可以诱导相关基因转录，从而促进诱导异位内膜细胞增殖[23]；并可以抑制肿瘤坏死因子α诱导的凋亡过程[24]。β-联蛋白(β-catenin)反映上皮细胞间充质转化，β-catenin主要作用于细胞骨架，能够与上皮细胞的钙黏蛋白构成复合体，对细胞间的相互黏附作用进行介导。研究结果指出，在EMT发病的初始阶段，ER能够与β-catenin的雌激素反应元件结合进而启动β-catenin的转录，促进异位内膜细胞的EMT[25]。在异位病灶形成过程中，ER上调β-catenin转录激活了Wnt/β-catenin信号通路，后者能够直接促进VEGF的转录，促进病灶周围小血管的形成，为病灶形成提供物质基础。

孕激素抵抗是EMT形成的重要机制，但抵抗的具体原因不完全明确[26]。Tanaka等[27]指出，在EMT中，雌激素和孕激素信号可以调节大麻素受体mRNA的表达，说明三者之间存在联系，影响着EMT的发生发展。

ALOX5是炎症介质白细胞三烯和脂氧素生成的一个起始酶，在肿瘤等疾病中通常表达量过高[28]。EMT为一种良性肿瘤，但其发病机制与一般的恶性肿瘤具有一定的相似性。孙平平等[29]认为，ALOX5在EMT组织中的高表达，与EMT发病存在一定关系，通过上调VEGF表达促进EMT新生血管形成。

综合上述药物作用的靶点，桂枝茯苓丸可能通过CB1、CB2、ESR、PGR和ALOX5等靶点调控EMT中异位内膜细胞的增殖抗凋亡、黏附、侵袭和血管生成的过程，从而起到治疗EMT的作用。

3.5 桂枝茯苓丸治疗EMT的潜在通路预测分析

从KEGG通路富集分析结果可知，在治疗过程中可能涉及的主要通路为MAPK信号通路。MAPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在哺乳动物体内广泛存在，并接受细胞外信号刺激，参与细胞增殖、分化、迁移以及衰老的过程；同时，其与炎症、肿瘤等多种疾病的发生关系密切[30]。ERK1/2、c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38)和细胞外信号调节激酶5(ERK5)均为MAPK信号通路，且各分支通路的生物效能各不相同[31]。MAPK信号通路调节EMT中异位子宫内膜细胞黏附、侵袭、血管生成和抗凋亡的过程，参与EMT的发生发展[32]。MAPK信号通路还可促进异位内膜细胞的侵袭，主要作用机制为作用于多种细胞黏附分子介导的细胞黏附运动。侵袭过程涉及到细胞外基质的降解过程，基质金属蛋白酶(MMP)是该过程中的主要酶类，多种因子可以通过通路间接调控MMP的表达，有利于异位侵袭种植。新生血管形成是EMT异位病灶形成的关键，异位病灶需要足够的血液供应支持，并且其快速生长离不开大量新生血管的供应。在环氧合酶-2(COX-2)的诱导下，VEGF可加速合成，促进新血管的生成。Huang等[33]研究结果指出，EMT中过量表达的白细胞介素1β通过MAPK信号通路刺激COX-2的表达，间接促进了VEGF的表达。

综上所述，本研究利用网络药理学方法与技术，挖掘到桂枝茯苓丸中51种类药性成分及823个潜在靶点，EMT相关靶点1 600个，其中桂枝茯苓丸-疾病共同靶点190个；进行GO生物分析初步预测出桂枝茯苓丸可能通过调节CB1、CB2、ESR、PGR和ALOX-5等靶点，通过KEGG通路富集分析和过程分析初步预测出桂枝茯苓丸可能通过调控MAPK信号通路，从而发挥抗炎、抗肿瘤和促凋亡等作用，从EMT中异位内膜细胞的黏附、侵袭和血管生成等病理过程干预，达到治疗EMT的作用，对临床治疗具有重要意义。网络药理学是依托于已研究出的数据，借助各种平台数据库数据及配套的软件算法进行分析，得出的结果可作为实验研究的线索，其具体的作用机制还有待实验研究证实。