miRNA-499预测心脏术后新发心房颤动的研究

徐志伟，钱 龙，黄 苏

淮安市第一人民医院，南京医科大学附属淮安第一医院心脏外科（淮安 223300）

心脏手术后新发心房颤动(postoperative atrial fibrillation，POAF)的比例较高，尤其是心脏瓣膜手术[1-2]。据报道，POAF 的发生率为20%～50%。POAF 与多种因素有关，包括体重指数[3]、性别、慢性阻塞性肺疾病、瓣膜心脏病[4]、心外膜脂肪组织[5]，以及阻塞性睡眠呼吸暂停[6]等，但确切机制目前仍不清楚。

MicroRNAs(miRNAs)是一类短小非编码RNA，在细胞增殖、分化、信息和凋亡等生物学过程中发挥着重要作用[7-8]。人类基因组编码1 000 多个miRNAs，其中30%在心血管系统中可以检测到[9-10]。多种miRNAs参与调节心房收缩力、离子通道性能和自律性[11-12]。

部分miRNAs 的异常表达可能与POAF 有关，并在其发病过程中起关键作用[13-14]。既往研究证实心脏术后POAF病人和正常对照组病人(非POAF)外周血miRNAs表达量的差异[15]。本研究通过外周血miRNA-499的表达差异证实其对POAF 的预测作用，此外，还评价了miRNA-499作为生物标志物监测POAF病人使用胺碘酮进行治疗的有效性。

1 对象和方法

1.1 研究对象

本研究由江苏省淮安市第一人民医院伦理委员会批准，所有纳入本研究的病人均征得知情同意。纳入2020年1月至9月接受心脏瓣膜手术的POAF病人109例。通过匹配相关的临床变量(如年龄、性别)以及临床特征(如高血压、体重指数、心肌梗死、吸烟、左心室射血分数和体外循环)，选择既往96 名非POAF 心脏瓣膜手术病人为正常对照组。POAF 定义为从心脏手术后即刻开始至出院心电监护记录到房颤持续时间＞30 min。所有病人均通过术前12导联心电图或者动态心电图及病史排除既往房颤病史。其他排除标准包括有严重呼吸系统疾病史、神经系统疾病史、凝血障碍史、肾或肝功能不全史、目前除β-受体阻滞剂外的抗心律失常药物治疗、左心室射血分数＜35%或急诊手术。

POAF 组用胺碘酮按常规方案治疗术后新发POAF。出院前恢复窦性心律纳入胺碘酮治疗阳性组[胺碘酮（+）]，仍为房颤心律纳入胺碘酮治疗阴性组[胺碘酮（-）]。胺碘酮按推荐剂量给药(静脉负荷量150 mg，然后0.5～2 mg/min静脉维持，口服后静脉用药逐渐减量，口服200 mg，3 次/d，共5 d，然后改为1 次/d至术后1月。

1.2 临床样本收集

非POAF 病人于术后24 h 及出院前留取2 次外周静脉血标本，POAF病人于发生心房颤动30 min后及出院前留取2 次外周静脉血标本，其中出院前恢复窦性心律纳入胺碘酮治疗阳性组[胺碘酮（+）]，仍为房颤心律纳入胺碘酮治疗阴性组[胺碘酮（-）]。上述标本均留取外周静脉血5 mL，枸橼酸钠抗凝，使用miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen，Redwood City，CA，USA)提取包括miRNA 在内的总RNA。所有步骤均在生物安全柜中进行，并在冰上进行操作，以预防RNA 降解导致提取的RNA 总量降低。参照既往文献报道方法[8]，通过在每个血清样本中添加25 fmol 的cel-miRNA-39(Applied Biosystems，CA，USA)试剂进行均一化，以降低RNA 提取过程中样品变异问题对最终检测结果的影响。上述具体操作参照说明书进行。

1.3 实时聚合酶链反应

RT-PCR进一步检测miRNA-499的表达水平。参照试剂盒(Bioteke，Beijing，China)说明进行。加入SYBR Green PCR Master Mix (Applied BiStudioystems，USA)，进行PCR 扩增。RT-PCR 反应条件为：95 ℃，10 min 预变性；95 ℃，15 s 变性；60 ℃，1 min 退火延伸，45个循环进行扩增，每个样品重复3次。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料采用表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析（one way-ANOVA），两两比较采用LSD法，两个样本均数比较采用t检验；为探讨miRNA-499 作为预测标志物的潜力，绘制了受试者工作特征(the receiver operating characteristic，ROC)曲线，并通过灵敏度和特异度计算曲线下面积(AUC)。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料对比

POAF组病人109例（男40例，女69例），平均年龄(62.6 ± 7.7)岁；非POAF 组病人96 例（男39 例，女57例），平均年龄（60.3±5.1)岁。对两组病人的性别、年龄、体重指数、吸烟、高血压、心肌梗死、左心室射血分数等参数进行比较，均无统计学差异（P＞0.05，见表1)。POAF 组根据出院时心电图分为胺碘酮（+）组（n=76）和胺碘酮(-)组（n=33）。在推荐剂量下未观察到胺碘酮的不良反应。

表1 POAF组与非POAF组两组基本临床资料分析Table 1 Analysis of basic clinical data of POAF group and non-POAF group

2.2 miRNA-499在两组病人中的比较

在非POAF 组病人中，术后24 h及出院前miRNA-499 表达量差异无统计学意义（P＞0.05）；在POAF 组病人中，无论AF发生后30 min还是出院前miRNA-499表达量均较非POAF组病人术后24 h有明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；而胺碘酮(+)组在出院前较AF发生后30 min的miRNA-499表达量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；胺碘酮(-)组在AF 发生后30min及出院前miRNA-499 表达量的差异无统计学意义（P＞0.05）。和胺碘酮(-)组相比，出院前胺碘酮(+)组miRNA-499 表达量明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 各组病人外周血miRNA-499表达的比较（）Table 2 Comparison of the expression of miRNA-499 in peripheral blood of patients in each group（）

表2 各组病人外周血miRNA-499表达的比较（）Table 2 Comparison of the expression of miRNA-499 in peripheral blood of patients in each group（）

注：a表示出院前非POAE组与胺碘酮（-）组比较

2.3 POAF对胺碘酮治疗的反应

POAF组病人中，胺碘酮(+)组miRNA-499表达水平出院前明显低于胺碘酮(-)组，差异有统计学意义(t=2.636，P=0.009)。此外，ROC 曲线分析显示，以miRNA-499 的相对表达量作为区分胺碘酮(+)组和胺碘酮(-)组的最佳界值为0.3，其特异度为62%，敏感度为79%(AUC=0.72，P=0.006，见图1)。

图1 ROC曲线显示miRNA-499表达水平预测POAF病人对胺碘酮的治疗效果Figure 1 ROC curve showed that the expression level of miRNA-499 predicted the treatment effect of amiodarone in POAF patients

3 讨论

microRNA 是一类长度为18～25 个核苷酸的内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物中，参与调控细胞生长、分化和凋亡等各个环节[16-17]，在生物血浆中高度稳定，是一种简单、有效的新兴生物学标志物[18]。既往研究也证实阵发性房颤和持续性房颤病人表现出不同的miRNA表达谱[19-20]，能够对心房电重构产生影响，如miRNA-133、miRNA-1 通过对钾通道基因表达进行调节，可能对心脏电活动传导及节律产生影响，miRNA-21等参与钙通道的调节[21-23]。

在本研究中，我们比较了POAF病人与非POAF病人外周血中miRNA-499 的表达，结果表明POAF 组病人中，无论胺碘酮(+)组和胺碘酮(-)组miRNA-499的表达均显著高于非POAF 组病人。说明外周血miRNA-499表达的上调与心脏瓣膜术后POAF 的发生显著相关，可能与钾通道功能丧失有关，进一步研究或许可以通过miRNA-499 的表达预测术后POAF 的发生。

心脏电生理功能恶化，通过丧失部分离子通道功能来促进心房重构，是维持心房颤动的基础[24-25]，也导致部分持续性心房颤动用胺碘酮治疗效果不佳。本研究，评估了胺碘酮治疗的反应性，胺碘酮(-)组病人无论AF 发生后30 min 还是出院前miRNA-499 表达量无明显变化，与胺碘酮(+)组病人相比，胺碘酮(-)组出院前miRNA-499 表达量仍明显升高。ROC 曲线分析表明，miRNA-499预测胺碘酮治疗反应的特异性为62%，敏感性为79% (AUC=0.72)，验证了miRNA-499 可以预测胺碘酮对心脏瓣膜术后POAF病人的治疗效果。

4 结论

miRNA-499表达量增加可能有助于临床判断心脏术后POAF的发生，同时还可以预测胺碘酮对心脏瓣膜术后POAF病人的治疗效果。

（利益冲突：无）