10个马铃薯新育成品种的SSR分析

张海龙， 于 卓， 祁 娜， 于肖夏， 李景伟， 岳 东

(内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特 010019)

SSR(Simple Sequence Repeat)标记呈共显性，具有多态性位点丰富、重复性高等优点[1]，因其操作简单、成本低，在作物种质资源评价、分子标记辅助育种、遗传图谱构建和遗传关系分析等方面已得到广泛应用[2]。吴立萍等[3]用14对多态性高的SSR引物对54份马铃薯品种遗传关系进行分析，共扩增出多态性条带229个，从DNA分子水平上揭示了供试品种间的亲缘关系。本试验拟对10个马铃薯新品种的基因组DNA进行SSR分析，在分子水平上，明确10个马铃薯新品种的遗传差异性，为下一步作为马铃薯亲本进行杂交改良和新品种保护利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为内农薯1号(NNS-1)、内农薯2号(NNS-2)、内农薯3号(NNS-3)、内农薯4号(NNS-4)、内农薯5号(NNS-5)、内农薯6号(NNS-6)、红彩5号(HC-5)、紫彩1号(ZC-1)、紫彩2号(ZC-2)和紫彩3号(ZC-3)，均由内蒙古农业大学于卓教授带领的马铃薯育种团队新近育成品种(系)。

1.2 试验地概况

试验材料于2020年5月在内蒙古农业大学试验基地进行种植，该试验地位于111°45′ E～45°50′ N，海拔1 069 m，年降水量350～400 mm，无霜期约145 d。土质为沙壤质土，pH值在7.8～8.2之间，土壤肥力中等，具有灌溉条件。每种材料单行种植50株，株距25 cm，行距75 cm，播种深度约12 cm，种子级别为原种。

1.3 测定方法

1.3.1DNA提取与检测

在马铃薯苗期，随机取各材料顶端新鲜叶片，用北京天根公司生产的DNA试剂盒提取基因组DNA。取各材料DNA原液5 μL，用1.0%琼脂糖凝胶电泳对各材料进行纯度检测，将达到试验要求的DNA稀释至50 ng/μL，置于-40 ℃冰柜中留存备用。

1.3.2SSR引物来源及筛选

试验所用引物均从NCBI网站上公布的马铃薯SSR特异性引物中筛选获得，由上海生物工程有限公司负责合成。将各试验材料基因组DNA作为模板，对80对SSR适宜引物进行PCR扩增、电泳，从中选出多态性高、位点稳定、明亮的SSR引物10对(表1)，用于后续SSR分析。

表1 筛选出的10对SSR适宜引物及序列Table 1 10 pairs of SSR-appropriate primers and sequences screened

1.3.3SSR-PCR扩增体系及程序

SSR-PCR扩增体系：体系总体积20 μL，含样品DNA(50 ng/μL)2.0 μL，1.4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，10×PCR Buffer(Mg2+)2.1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，上游和下游引物各0.6 μL，ddH2O 13.1 μL。

扩增程序：在Bio-Rad Mycycler Thermal Cycler上进行扩增，程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循环5次；94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循环35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃下终止反应。

1.3.4扩增产物检测

将5 μL变性剂加入PCR扩增产物中，在94 ℃下变性5 min，储存于4 ℃冰箱备用。每种材料吸取变性后的PCR扩增产物5 μL点样，用100 bp的DNA Marker作对照，电泳恒定功率70 W，电泳时间75 min。电泳结束后，将电泳胶板取下，于固定液内固定16 min；固定结束后用蒸馏水漂洗2～3 min，于2.0%的硝酸银溶液中染色15 min，再用蒸馏水速漂4～6 s；置显影液中进行显色，待DNA条带显色清晰为止。晾干胶板，观察记录条带位点和标记数目、照相[4-5]。

1.3.5数据处理

利用0/1赋值法[13]统计电泳胶板上扩增出的SSR多态性位点，用“1”表示条带清晰，“0”表示没有条带，“-”表示缺失的条带，最终生成“1”/“0”的原始二元数据矩阵，不统计没有多态性的位点，多态性条带位点百分率(P)计算公式为：

P(%)=(K/N)×100%

式中：K为多态性条带位点总数，N为条带位点总数[14]。用DPS(Data Processing System)软件中的类平均聚类法(UPGMA)计算各品种间的遗传距离，并对各品种进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 供试材料基因组DNA纯度检测

由图1可见，各材料基因组DNA电泳条带清晰、明亮、无拖尾和降解现象，表明各试验材料的DNA纯度高，完全达到SSR-PCR扩增实验的要求。

注：M为DL 2000；1为NNS-1；2为NNS-2；3为NNS-3；4为NNS-4；5为NNS-5；6为NNS-6；7为HC-5；8为ZC-1；9为ZC-2；10为ZC-3。下同。 图1 马铃薯新品种基因组DNA电泳检测结果Fig.1 Results of DNA electrophoresis testing for genome of new potato varieties

2.2 马铃薯新品种基因组DNA的SSR扩增

利用筛选出的10对SSR适宜引物对各试验材料基因组DNA进行PCR扩增、电泳并统计其多态性位点条带，结果(表2、图2和图3)表明，共有139个条带稳定、清晰的SSR标记位点，其中含有SSR多态性位点条带117个，多态性位点占总标记位点的84.17%，平均每对引物扩增出11.7个多态性条带位点。引物S 189和S 25能很好地将10个马铃薯新品种清晰区分开，并分别构建了SSR指纹图，为新品种的鉴定和登记利用提供了分子依据。

图2 引物S 189对10个马铃薯材料基因组DNA扩增的SSR指纹特征Fig.2 SSR fingerprint characteristics of genomic DNA amplification of 10 new varieties with primer S 189

图3 引物S 25对10个马铃薯材料基因组DNA扩增的SSR指纹特征Fig.3 SSR fingerprint characteristics of genomic DNA amplification of 10 new varieties with primer S 25

表2 各新品种的SSR扩增结果Table 2 SSR amplification results for each new variety

2.3 马铃薯新品种的遗传距离和聚类分析

由表3和图4可以看出，10个马铃薯新品种间的遗传距离(GD)变幅为0.126 4～0.714 3，平均遗传距离为0.555 4，材料NNS-4和ZC-1之间的遗传距离最大，为0.714 3，其亲缘关系较远；材料ZC-2和ZC-3之间的遗传距离最小，为0.126 4，说明这两个新品种间的亲缘关系较近。以GD值0.55为基准，将10个马铃薯品种分为四类：NNS-1、NNS-2和HC-5为第一类；NNS-3、NNS-4和NNS-5为第二类；ZC-1、ZC-2和ZC-3为第三类；NNS-6为第四类。

表3 各品种(材料)的遗传距离矩阵Table 3 Genetic distance matrix for each new varieties

图4 10个马铃薯材料的SSR聚类结果 Fig.4 SSR clustering results for 10 new potato varieties

3 讨论与结论

SSR分子标记也被称为微卫星DNA，即简单重复序列。SSR分子标记技术主要包含PCR扩增反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳两个关键实验步骤，具有重复性好、操作简单，可在较短时间内获得大量的SSR多态性位点，明显提高了SSR引物的利用效率[2]。在SSR标记分析过程中，所选引物和供试材料是分子标记扩增位点多态性高低的关键因素，可明确显示出作物个体之间的遗传差异性，标记多态性越高，说明个体间的遗传差异越大[10]。近年来，SSR标记技术已广泛应用在作物的遗传多样性分析等研究中。李靓等[11]利用筛选出的10对SSR适宜引物，对7个马铃薯供试材料的基因组DNA进行扩增，经对试验结果统计分析，共获得多态性条带82个，多态性比率占78.10%；宋峥等[12]利用筛选的10对适宜性引物，对44份马铃薯种质材料进行PCR扩增，共获得108个SSR多态性位点，多态性比率88.5%。刘宇飞等[13]利用筛选出的10对SSR特异性引物，对5个马铃薯新品系基因组DNA进行PCR扩增，分析实验结果表明，其中SSR多态性位点有94个，多态性比率为72.23%。

本实验以杂交选育的10个马铃薯新品种内农薯1号、内农薯2号、内农薯3号、内农薯4号、内农薯5号、内农薯6号、红彩5号、紫彩1号、紫彩2号和紫彩3号的基因组DNA为材料，利用筛选出的10对SSR适宜引物对各供试材料基因组DNA进行扩增，经分析聚丙烯凝胶电泳数据显示，本实验共获取117个SSR多态性条带位点，多态性比率为84.17%，结果表明，在DNA分子水平上，10个马铃薯新品种之间存在显著差异，同时利用特异性引物S 189和S 25构建了2张能明确区分各供试材料的SSR指纹图。聚类分析显示，10个马铃薯新品种的GD值变幅为0.126 4～0.714 3，以GD值0.55为基准，将10个马铃薯试验材料划分为四类：第一类为NNS-1、NNS-2和HC-5；第二类为NNS-3、NNS-4和NNS-5；第三类为ZC-1、ZC-2和ZC-3； NNS-6为第四类。本研究再次证明SSR技术用于马铃薯品种间遗传差异分析是可行的。