异源表达棉花GhPAO3基因对拟南芥种子萌发的影响

成新琪， 庞芳芹， 汤欣欣， 乌 兰， 胡孝明， 朱华国

(黄冈师范学院生物与农业资源学院/经济林种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室， 湖北 黄冈 438000)

多胺(Polyamines，PAs)是含有两个或两个以上氨基，并存在于生物体内具有生物活性的脂肪族含氮碱。植物体多胺主要有腐胺(Putrescine，Put)、亚精胺(Spermindine，Spd)、精胺(Spermine，Spm)和热精胺(Thermospermine，Tspm)。此外，生物体内存在着稀有多胺[1]。研究发现，多胺在植物生长和适应环境变化中扮演重要的角色[2-3]，诸如细胞分裂和分化、胚胎发生、组织发生、生物以及非生物胁迫的响应等[4-8]。目前，多胺主要的合成和分解代谢途径已基本被揭示[9]，与植物体多胺合成和代谢有关的部分基因已被克隆，并获得转基因阳性植株[10-11]。

多胺的降解主要是通过二胺氧化酶(DAO)和多胺氧化酶(PAO)催化来实现，二胺氧化酶氧化腐胺和尸胺，产物包括4-氨基正丁醛、氨和H2O2。多胺氧化酶有多个同源基因[10-11]，其代谢途径分为两类，一类是催化Spm和Spd生成1,3-丙二胺(Dap)、H2O2和3-氨丙基-4-氨基正丁醛或4-氨基正丁醛；另一类是催化Spm生成Spd，再生成Put，同时生成3-氨基正丁醛和H2O2[4-6]。多胺氧化产生H2O2可以作为一种信号分子参与植物体内细胞的程序性死亡、细胞的防御性反应、细胞质木质素合成和生物与非生物胁迫等过程[12]。

H2O2是生物体细胞在代谢中产生的一种活性氧(ROS)，正常生长情况下，植物体内的ROS清除系统能使H2O2的含量保持一定的水平，使植物体免受伤害，但在逆境胁迫条件下，活性氧的产生超出系统清除能力范围时，对植物体造成氧化损伤[13]。对H2O2深入的研究，认识到H2O2对植物生长和代谢的影响，H2O2参与了植物种子萌发和根的生长等过程，尤其是当植物受到胁迫时，H2O2的作用已成为了胁迫研究的热门课题[14]。ROS对植物生长发育也有重要作用，能对植物细胞产生一定程度的损害，但适宜浓度的ROS对激活植物应对胁迫的防卫有重要作用[15-18]。本研究以野生型(WT)和过表达GhPAO3转基因拟南芥为材料，研究不同浓度NaCl对拟南芥种子萌发的影响，揭示外源多胺对转基因拟南芥种子子叶变绿的影响，为研究多胺响应盐胁迫的生理机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料处理

选取WT和3个纯合转GhPAO3基因株系(3-5、3-15和3-19)的拟南芥种子为实验材料，用15%次氯酸钠消毒20 min，不断振荡，在超净台中用无菌水冲洗3～4次，播种于1/2 MS固体培养基上，低温(4 ℃)春化2 d，转移至22 ℃人工培养箱中培养。

1.2 转基因拟南芥植株盐处理

以转基因株系3-15为实验材料，种植于0、50、100、150、200 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基上，统计其发芽率和子叶变绿的百分率。

1.3 外源多胺处理

不同浓度(0.2、1、2 mmol/L)的Put、Spd、Spm、D-Arg 和1,8-DO处理，调查统计WT和转基因拟南芥子叶变绿的百分率。

1.4 H2O2含量测定

取WT和转基因株系相同部位叶片(0.2～1.0 g)，放入含有液氮研钵中充分研磨，将粉末移至2 mL离心管中，按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例往离心管中加入0.86%的生理盐水，充分混匀，4 ℃，200 r/min离心10 min，取上清液于干净离心管进行H2O2含量测定，采用南京建成科技有限公司H2O2测定试剂盒。

1.5 数据统计

发芽率(%)=(第n天发芽的种子数/所用种子总数)×100%；

子叶变绿百分率(%)=(第n天子叶变绿的数量/所用种子总数)×100%，

式中，n为种子发芽的天数，子叶变绿数量指拟南芥发芽时叶片变为绿色的数量，发芽在22 ℃恒温培养箱中进行，含水量恒定，每天记录发芽种子数和子叶变绿的数量，实验设3次重复。

2 结果与分析

2.1 NaCl处理下转GhPAO3拟南芥种子萌发情况

不同浓度NaCl条件下WT和转GhPAO3拟南

芥种子萌发的结果表明，在0(图1 A)和50 mmol/L NaCl(图1 B)处理中，WT和转基因种子发芽率无明显差异；100 mmol/L NaCl处理转基因拟南芥发芽率略低于WT(图1 C)；150 mmol/L NaCl处理后推迟1 d发芽(图1 D)，且转基因株系发芽率低于WT；200 mmol/L NaCl处理下则推迟至第4天发芽(图1 E)，WT和转基因的发芽率都显著下降，第7天的发芽率分别为54%和49%。随着NaCl浓度的提高，拟南芥种子的萌发抑制更加明显，转基因拟南芥种子对NaCl更加敏感。

注：A～E分别表示0、50、100、150、200 mmoL NaCl处理下WT和转基因拟南芥种子发芽率；图片上方是对应处理条件下种子的发芽率。图1 NaCl胁迫下WT和GhPAO3拟南芥种子的发芽率Fig.1 Germination rate of WT and GhPAO3 seeds under NaCl stress in Arabidopsis

2.2 NaCl处理下外源多胺和多胺抑制剂对拟南芥子叶的影响

种子萌发实验发现，100 mmol/L NaCl处理下WT和转基因拟南芥种子发芽率开始出现差异，且子叶变绿情况差异明显。WT在第3天出现绿色子叶，而转基因株系在第4天出现绿色子叶，且转基因拟南芥子叶变绿的数量明显低于WT(图2 A)。为揭示转基因株系在100 mmol/L NaCl处理下出现子叶变绿差异的原因，在100 mmol/L NaCl条件下分别添加不同浓度(0.2、1、2 mmol/L)外源多胺(Put、Spd、Spm)、多胺抑制剂(D-Arg)和多胺氧化酶(PAO) 抑制剂(1,8-DO)研究对子叶变绿的影响。结果表明，Put(2 mmol/L)、Spd(2 mmol/L)、Spm(2 mmol/L)处理时，WT与转基因株系子叶变绿存在差异。加入Put时，WT和转基因株系子叶变绿数量均有所提高，且转基因株系子叶变绿提前(图2 B)，而加入Spd和Spm后，WT和转基因株系子叶变绿都推迟1 d(图2 C和图2 D)，加入不同多胺处理时转基因子叶变绿百分率均低于WT(图2 A-图2 D)，但在第7天对照(图2 A和图3 A)和Put处理(图2 B和图3 B)子叶变绿百分率均达到100%；加入Spd和Spm，第7天仍存在差异(图2 C和图3 C；图2 D和图3 D)。而当加入D-Arg(1 mmol/L)和1,8-DO(1 mmol/L)后，第7天也未出现子叶变绿的现象(图2 E和图3 E；图2 F和图3 F)。因此，推测NaCl处理和过表达GhPAO3基因可能通过改变H2O2含量影响拟南芥子叶变绿。

注：A为100 mmol/L NaCl处理下WT和转GhPAO3拟南芥子叶变绿的百分率；B、C、D、E、F分别为100 mmol/L NaCl和多胺(Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO)处理下转GhPAO3和拟南芥子叶变绿的百分率。图2 NaCl处理和外施多胺条件下WT和GhPAO3拟南芥种子的子叶变绿的百分率Fig.2 Percentage of greenish cotyledons of WT and GhPAO3 seeds under NaCl treatment and external application of polyamines in Arabidopsis

注：A为100 mmoL NaCl处理下GhPAO3和拟南芥第7天子叶变绿的差异；B、C、D、E、F分别为多胺(Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO)处理下WT和转基因GhPAO3拟南芥第7天子叶变绿的差异。图3 NaCl处理和外施多胺条件下WT和转基因GhPAO3拟南芥第7天子叶变绿的百分率 Fig.3 Percentage of cotyledons turning green on the 7th day of WT and GhPAO3 under NaCl treatment and external application of polyamines in Arabidopsis

2.3 外施多胺、D-Arg、1,8-DO对拟南芥子叶的影响

为进一步研究子叶变绿差异，在1/2 MS培养基上分别加入外源Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO统计子叶变绿情况(图4和图5)。结果显示，1/2 MS培养基上WT和转基因株系子叶变绿没有差异，第3天出现子叶变绿，第6天达到100%(图4 A和图5 A)。添加外源1,8-DO处理后WT和转基因株系的子叶变绿的百分率均有所提高，其中加入Put、Spm、1,8-DO后，子叶变绿提前出现，即第2天出现绿色子叶(图4 B、D、F)；加入Spd，第3天出现绿色子叶(图4 C)；而加入多胺抑制剂D-Arg时，绿色子叶推迟至第5天出现(图4 E)。此外，加入外源多胺(Put、Spd、Spm)后，WT子叶变绿的百分率高于转基因株系；而加入D-Arg后，转基因子叶变绿百分率高于WT；加入1,8-DO后，WT和转基因子叶变绿百分率基本一致。因此，加入外源多胺时，对拟南芥子叶变绿具有促进作用，但与WT相比，转基因株系的子叶变绿的百分率有所降低，可能是过表达株系产生更多的H2O2，对子叶变绿具有一定抑制作用。

注：A为1/2 MS培养基WT和转GhPAO3拟南芥子叶变绿百分率差异；B、C、D、E、F分别加入多胺(Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO)处理下转GhPAO3和拟南芥子叶变绿百分率差异。图4 外施多胺条件下WT和转GhPAO3拟南芥种子子叶变绿百分率Fig.4 Rate of green cotyledons of WT and GhPAO3 seeds under external application of polyamines in Arabidopsis

注：A为1/2 MS培养基WT和转GhPAO3拟南芥第7天子叶变绿差异；B、C、D、E、F分别为多胺(Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO)处理下WT和转基因GhPAO3拟南芥第7天子叶变绿差异。图5 外施多胺条件下WT和转GhPAO3拟南芥第7天子叶变绿情况 Fig.5 Green cotyledon of WT and GhPAO3 transgenic on the 7th day under the condition of external application of polyamines in Arabidopsis

2.4 外施多胺和多胺抑制剂对拟南芥H2O2含量的影响

外施多胺和多胺抑制剂条件下WT和转基因株系H2O2含量分析显示，当加入Put、Spm或1,8-DO后，与WT相比，转基因株系产生H2O2的量明显升高，差异达极显著水平；加入Spd后，转基因株系产生H2O2的量升高，差异达显著水平；当加入D-Arg后，转基因株系产生H2O2的量明显降低，差异达极显著水平(图6)。

注：“*”表示差异显著(p<0.05)；“**”表示差异极显著(p<0.01)。图6 不同处理条件下WT和转GhPAO3拟南芥H2O2含量Fig.6 Detection of H2O2 content in WT and GhPAO3 transgenic Arabidopsis under different treatments

3 结论与讨论

种子萌发是植物生长发育过程中的重要阶段，受温度、水分和氧气等影响，同时也受植物体内激素和多胺等的调节，研究发现，添加外源多胺可以促进莴苣种子[19]或抑制水稻种子[20]的萌发。越来越多的研究表明，多胺参与植物抗盐方面的重要作用[2]，PAO催化多胺产生H2O2，参与植物的生长发育和非生物胁迫[10]。

NaCl处理(图2 B)和正常(图4 B)条件下，加入外源Put均促进子叶变绿的产生。Afzal等[21]和Verma、Mishra[22]研究发现，外源Put能促进盐处理下种子的萌发，提高种子和叶片的抗氧化能力，减少脂膜过氧化的程度[7]，有利于种子萌发和植株生长发育，与本研究结果相似。同时，NaCl处理条件下，外源Spd(图2 C)和Spm(图2 D)处理下拟南芥子叶变绿的百分率降低，并且所有处理条件下，转基因株系子叶变绿的百分率低于WT，同时发现转基因株系较WT积累更多H2O2[11]，推测NaCl处理和外源多胺处理下，Spd和Spm大量进入拟南芥体内，之后被 PAO分解，产生更多的H2O2对细胞膜产生伤害作用，并且过表达株系促进植物体内多胺降解产生H2O2，导致转基因株系子叶变绿百分率低于WT，本研究结果与Wang等[23]研究的结果一致。正常条件下，外源Put(图4 B)、Spd(图4 C)、Spm(图4 D)和1,8-DO(图4 F)处理拟南芥种子，其子叶变绿百分率均有所提高，但转基因株系子叶变绿百分率低于WT(图4)，H2O2测定显示，转基因株系中H2O2含量高于WT(图6)，与图4结果一致，是因为转基因株系过表达氧化多胺产生更多H2O2，但是没有NaCl处理条件下H2O2含量积累明显[11]。因此，与对照相比，外源多胺对拟南芥有一定的促进作用，与张凤芝等[24]研究莴苣种子萌发结果一致。

植物体H2O2的产生和清除保持着动态平衡，细胞内活性氧的含量较低时，活性氧有一定的生理功能，使植物的伤害降到最低。胁迫条件下，H2O2等活性氧产生和清除的动态平衡被打破，生长量高于清除量，使植物体内H2O2等ROS含量积累。因此，H2O2在植物体内扮演双重角色，低浓度的H2O2可以作为信号分子参与逆境胁迫，促进植物生长和提高抗逆性，而高浓度的H2O2对细胞膜的破坏和氧化胁迫的加剧，甚至加速植物细胞程序性死亡的进程[2,10]。研究发现，H2O2等ROS的含量过量会导致细胞内的生物大分子氧化损害，高含量的H2O2使蛋白分子内或分子间的二硫键产生交联，使含有巯基的酶活性降低甚至失活，同时，H2O2还可以激活蛋白水解酶等的活性，加快植物蛋白的降解，最终使植物体内的生理反应受到抑制[25]。因此， NaCl处理过表达GhPAO3拟南芥时，拟南芥体内通过NaCl胁迫和PAO氧化多胺同时产生H2O2，产生的H2O2含量超过植物体承受的阈值，对植物产生危害，从而表现对NaCl胁迫更敏感。关于拟南芥过表达GhPAO3在NaCl胁迫产生H2O2的阈值是后期研究工作的重点。