双边栝楼的组织培养与快速繁殖

张冰冰, 叶艳英, 周劲松, 汤泳萍, 尹玉玲, 罗绍春

(江西省农业科学院蔬菜花卉研究所， 南昌 330200)

refine seedlings and transplant

双边栝楼(TrichosantheskirirowiiMaxim)俗名吊瓜、药瓜、野葫芦等，为葫芦科栝楼属的多年生攀缘草质藤本植物[1]，其果实(全栝楼)、种子(栝楼籽)、果皮(栝楼皮)及根(天花粉)均可入药[2]。栝楼具有改善心血管、祛痰止咳、抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗溃疡、抗菌等药理作用[3]。栝楼籽风味独特，可食率达60%[4]，入药或休闲食品的研发推广，其保健作用和食用价值都得到市场的认可。近年来，栝楼在农业结构调整和助力精准脱贫中发挥了巨大作用，产业前景广阔。

栝楼属雌雄异株，种子繁育后代的雌雄株比约为3∶7[4]，幼苗期雌雄株无典型性状差异，直至开花期才能辨别且后代性状分离严重，种子不宜用于繁育种苗。目前生产上基本采用1～2年生植株当年生新根繁育种苗，繁殖系数低，种根易受病虫侵害，种性退化严重。利用植物组织培养，建立栝楼无性快繁体系，可快速定向繁育出性状优良、基因稳定的优质种苗，弥补种子与块根繁育的不足，实现优质栝楼的市场推广。阮建等[5]、钱骅等[6]对其组织培养展开研究，但建立的体系差异较大。笔者选用数种已建立的栝楼组织体系对双边栝楼皖楼20号进行组织培养，发现并不适用。究其原因可能与所取材料品种(材料基因型)、生长年龄或生长时期有关。因此，本研究针对已建立的栝楼组培快繁体系进行适应性优化，旨在为双边栝楼的组培快繁与工厂化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为双边栝楼皖楼20号一年生块根，2020年2月下旬种植于江西省农业科学院高安创新示范基地(115°E、28°N)。于5—7月份采集生长健壮的优质单株带腋芽茎段为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1材料灭菌与接种

取新生幼嫩的栝楼枝条放入冰盒中带回实验室，剪去多余的叶和叶柄，洗洁精清洗浸泡20 min清除灰尘，流水冲洗约30 min，将茎段剪成上下2～3 cm带芽小段，茎段不宜过短，无菌水冲洗3～4次，用灭菌滤纸吸干水分。于超净台中将其放入无菌培养瓶中，采用4种方式进行灭菌(表1)，最后用灭菌滤纸吸干水分，接入纯MS培养基中，MS培养基添加0.1 g/L的益培灵，抑制微生物的污染。分别于第4天、第7天和第13天统计污染率。

表1 外植体的不同灭菌方式Table 1 Different methods of sterilization of explants

1.2.2培养基与培养条件

外植体各时期诱导培养基组成(表2)，MS+不同种类和水平的激素+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂粉，pH值5.8。高压灭菌锅116 ℃灭菌30 min。各时期培养条件：专用组培室温度为(25±1)℃，光照时长12 h/d，光照强度2 000～3 000 lx。

表2 各时期外植体组织培养的MS培养基Table 2 MS medium for tissue culture of explants in each period

1.2.3接种与统计

获得的无菌外植体接种至初代诱导培养基，每处理10瓶，每瓶接种3～4个，于第3天、第5天、第7天和第20天观察并记录芽诱导情况，并于第20天计算各处理栝楼外植体的分化系数。栝楼芽点长至3～4 cm高时，分剪成带芽茎段，转接至不同增殖培养基，每处理10瓶，每瓶接种3～4个，20 d后观察并记录茎段的增殖情况，筛选最佳增殖培养基。选择苗高3 cm以上且带有3个或3个以上茎间段的无菌苗接种至生根培养基，每处理10瓶，每瓶接种3～4个，观察并记录外植体的生长状况及生根情况，筛选最佳生根培养基。最后，将根系健壮组培苗瓶盖打开，放入少许水炼苗2 d，然后洗去根部附着培养基，移栽至混合比为1∶1的蚯蚓土和育苗基质的花盆中，放置光照培养箱中并覆盖白色塑料薄膜，防止水分蒸发。光照设置2 400 lx、光照时长12 h/d、温度26 ℃、湿度70%，于第4天缓苗后除去薄膜，7～10 d后，移栽至田地中。

1.3 数据统计分析

采用WPS软件进行试验数据的统计分析。相关指标的计算公式为：

腋芽萌发率(%)=[萌发出腋芽(成活)的外植体总数/接种外植体总数]×100%；

分化系数=诱导分化芽点总数/接种成活外植体初芽点总数；

平均芽点数=外植体生长总芽点数/外植体个数；

增殖系数(%)=(芽生长到可供切割或增殖的外植体数/接种时的单芽或单外植体总数)×100%；

生根率(%)=(生根的无菌苗/接种的无菌苗总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 灭菌试验

于第4天、第7天和第13天分别对每处理组外植体污染个数进行统计，并在第13天计算各处理的污染率(表3)。结果表明，第4天各处理污染个数较少，处理1和处理3无污染外植体，处理2和处理4有细菌污染。第7天污染外植体显著增加，增长率在18%～53%之间，且污染外植体以真菌污染为主，在其基部或茎段有菌丝产生，多以白色孢子为主，个别有黑色孢子发生。第13天各处理污染率降低，处理3的污染率降到10%以下。综合统计处理2总污染率最高(84%)，处理3的污染率最低(26.3%)。所以处理3(75%酒精30 s+无菌水冲洗2～3次+0.1% HgCl210 min+无菌水冲洗3～4次)对栝楼外植体的灭菌效果最好。

表3 不同灭菌方式外植体污染情况Table 3 Statistical analysis of the contamination of explants in different sterilization methods

2.2 初代诱导培养

将无菌外植体分别接种至1～4号培养基进行诱导，第3天和第5天统计各培养基褐化外植体总数，第7天统计死亡和成活总数，第20天统计诱导芽总数，并计算分化倍数。结果(表4)显示：低浓度激素组合明显优于高浓度组合，即褐化外植体总数依次为培养基1号<2号<4号<3号，死亡总数依次为2号<1号<3号<4号。第7天发现各培养基外植体基部均膨大有愈伤产生，高浓度激素组合基部膨大较快且产生愈伤较多，此时芽点已经伸长。第12天已经有节间段产生，且叶片开始展开(图1 A、图1 B)。2号培养基芽点总数最多，为57个，4号同比高浓度激素组合芽点总数最少，为18个，分化倍数从大到小依次为2号、1号、3号、4号。因此，最佳初代诱导培养基为2号培养基(MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L)。

2.3 茎段增殖培养

将上述诱导茎段转接至增殖培养基，第20天随机选择其中3瓶的无菌株，观察记录茎段的增殖情况，并计算平均分化茎段数(增殖倍数)和平均芽点数(表5，图1 C)。6号培养基茎段增殖倍数最大(4.75)，显著大于5号与7号培养基的增殖倍数，各培养基外植体生长状态详见表5。因此，栝楼最佳茎段增殖培养基为6号培养基(MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L)。

表5 各培养基茎段增殖统计与描述Table 5 Statistics and description of stem proliferation of each medium

2.4 无菌株生根培养

将无菌茎段分别转接至8～11号生根培养基，观察并记录生根情况(表6，图1 D、图1 E)。第4～6天发现各培养基无菌株基部有少量愈伤产生。9号培养基第7天栝楼苗开始生根，继续培养15 d主根系变长且粗壮，伴随有侧根产生，第19～20天观察根系发达，组培苗生长健壮。8号培养基相对9号培养基生根率较低，相差58%，且平均每株生根数较9号培养基少2～3条。9号培养基第7天最先生根，8号培养基第10天开始有根产生，11号培养基18 d以后个别外植体有根产生，截止第20天，10号培养基无菌株无根系产生，11号培养基仅2株无菌株生根，其绝大多数外植体基部膨大凸起，被愈伤包裹，无生根迹象。因此，最佳生根培养基为9号培养基(MS+ IBA 0.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L)。

表6 各培养基诱导生根统计与描述Table 6 Statistics and description of induced rooting of each medium

2.5 组培苗炼苗移栽

随机挑选30株上述生根组培苗，炼苗移栽，截止第15天时统计死亡3株，组培苗清洗时因为其茎秆和根系较脆，清洗掉根死亡1株，成活率为86.7%，成活率较高。

3 结论与讨论

目前外植体常用灭菌剂有75%酒精，0.3%～0.6% NaClO和0.1% HgCl2，选用何种灭菌剂和灭菌时间由外植体部位及幼嫩程度所决定。一般在彻底杀死表面微生物的同时，又要尽可能减少灭菌剂对外植体组织和表层细胞的伤害。本研究选用上述灭菌剂，采用单一灭菌剂对比交替灭菌的方式，发现交替灭菌效果(平均总污染率35.7%)明显优于单一灭菌剂的效果(平均总污染率71%)。所以，在实践中可以采取交替灭菌和多次灭菌相结合的方式，以达到灭除杂菌的目的。本研究发现，使用75%酒精30 s+无菌水冲洗2～3次+0.1% HgCl210 min+无菌水冲洗3～4次效果较好，污染率为26.3%。虽然0.1% HgCl2在建立外植体无菌系中起着重要作用，显著优于其他灭菌剂，但HgCl2附着其外植体表面，无菌水难以彻底清洗干净，会对切口处造成损伤，增加褐化，抑制生长。因此，在初次修剪时，将茎段剪成上下2～3 cm带芽小段，方便HgCl2灭菌后剪去切口。其次，HgCl2属于重金属离子废液，对环境危害较大[7]。因此，建立效率高、危害小的灭菌体系是现实所需的。笔者前期采用钱骅等[6]的灭菌方法处理外植体，其除菌效果不太理想，原因可能与采样环境、外植体状态有关。种植基地距实验室较远，采样时均碰上雨天，极大地增加了外植体污染的概率。

在植物组织培养中，植物生长调节剂是培养基中的关键物质，在植物组织培养中起着重要的作用[8]。生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。如何平衡两者种类和比例以控制植物细胞的发育方向，是组织培养体系建立的核心。前人研究结果均表明，6-BA在外植体芽诱导中具有显著作用。如杨丽娜等[9]指出，MS+6-BA 1.5 mg/L最适合诱导栝蒌腋芽生长；江毅凡[10]指出，在MS+6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L诱导的分化苗质量较好；林贵美等[11]研究发现，MS+BA 0.3 mg/L+IBA 0.06 mg/L较适合初代诱导的启动培养。另廖华俊等[12]、曹孟德等[13]、陈惠等[14]都对其进行芽诱导研究，发现不同的体系激素水平差异较大，如BA浓度均在0.3～2.0 mg/L之间，且激素种类多围绕BA、IBA和NAA展开。笔者前期采用上述体系对徽记2号进行无性扩繁，发现各体系外植体诱导情况不佳，第3天出现死亡，于接种第5天绝大部分死亡且褐化程度严重，仅少部分诱导腋芽伸长。所以笔者设置4个相对低浓度组合进行诱导，发现相同6-BA用量条件下组配NAA分化倍数2.1比IBA分化倍数1.5更适宜芽的诱导，且6-BA的用量增大时，其分化倍数分别为1.4和1.3，明显抑制了芽的分化。综上，最佳诱导培养基为MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L。增大激素水平，根据茎段生长状态筛选增殖培养基，获得最佳增殖培养基为MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

IBA和NAA是诱导栝楼无菌株生根的关键激素，获得健壮根系吸收水分与养分，是最后移栽成活的关键。林贵美等[11]诱导生根为MS+IBA 0.3～0.5 mg/L，杨晓伶等[4]建立生根培养基MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L，钱骅等[6]诱导生根以MS+IBA 0.1 mg/L最好，其次是MS+NAA 0.1 mg/L。余慧琳等[15]、郑明福等[16]、韩琳娜等[17]对栝楼组培苗诱导生根都进行了相应研究，其激素水平绝大部分在0.5 mg/L及以下。笔者对上述部分体系进行生根诱导，发现材料的差异造成体系的不通用性，第25天统计各培养基生根率在8%以下，生根率极低，部分培养基无根系产生。所以笔者针对本皖楼20号增加了各激素的水平，设置4个组合对其生根进行诱导。发现IBA和NAA组合使用时诱导生根率高，当NAA与IBA水平同为0.6 mg/L时(MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L)，其根系发生快且健壮，移栽成活率高。

本研究初步建立了双边栝楼的组织培养快速繁殖体系，解决了已建立的栝楼组织培养体系对双边栝楼的不适用性，为双边栝楼的组培快繁与工厂化规范生产奠定基础，也可为栝楼属植物快速繁殖提供技术参考。