冠心病患者CCL20- CCR6 轴及IL- 17 表达与预后的相关性研究

周希 梁东杰 周晓东 高瞻 施翔翔

冠状动脉（简称冠脉）疾病（coronary artery disease，CAD）是全球范围内死亡的主要原因,其发病机制涉及脂质代谢失衡和不良免疫反应导致动脉壁的慢性炎症[1]。研究表明，趋化因子及其受体在协调白细胞流入血管壁方面起着重要作用，可调节血管免疫功能[2]。到目前为止，在人类基因中已经发现了50多种趋化因子和20 种趋化因子受体。根据趋化因子N 端半胱氨酸残基的数量和位置，将趋化因子分为四个亚家族（CXC、CX3C、CC 和C）[3]。参与动脉粥样硬化发生的趋化因子受体包括炎症受体Ccr2、Ccr5、Cxcr2、Cx3cr1 及经典的稳态受体Ccr7、Ccr6。趋化因子20（CC-chemokine ligand 20，CCL20）也被称为巨噬细胞浸润因子蛋白3a 或肝激活调节趋化因子，通过与其唯一受体趋化因子受体6（chemokine receptor 6，CCR6）合作参与动脉粥样硬化的发生[4]。然而，CCL20 在急性心肌梗死（acute myocardial in farction，AMI）和稳定型心绞痛（stable angina pectoris，SAP）患者中的表达尚不清楚。Th17 细胞分泌的白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）是CCR6 介导的动脉粥样硬化的另一个候选因子[5]，在冠心病患者中的表达尚不明确。本研究旨在探讨CCL20、CCR6 和IL-17 在冠心病患者中的表达及其与AMI预后的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2016 年7 至11 月温州医科大学附属第一医院心内科收治的冠心病患者206 例，均有冠脉造影指征。根据冠脉造影结果分为AMI 组96 例、SAP 组45 例及对照组（冠脉造影正常者）65例。AMI 组ST 段抬高型心肌梗死82 例，非ST 段抬高型心肌梗死14 例；行经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI）治疗92 例，行保守治疗4 例。3 组一般资料比较见表1。排除标准:年龄＜18 岁或＞90 岁，急性和慢性感染，自身免疫性疾病、严重心力衰竭、瓣膜性心脏病、肿瘤、严重肝肾功能障碍、甲状腺功能亢进、周围血管栓塞病或其他内分泌疾病，近期使用影响免疫反应的药物，缺血性卒中病史，怀孕，拒绝参与本研究者。本研究经过本院医学伦理委员会批准（批准文号：2017-145），所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）提取及CCR6 mRNA 表达水平检测 入组患者冠脉造影后立即取肘静脉血5 mL，EDTA 抗凝，2 000 r/min，离心20 min，提取PBMCs。在提取的PBMCs 中加入1 mL Trizol（美国Invitrogen 公司），混匀后置于-80 ℃冰箱中备用。使用Trizol 从细胞样本中提取总RNA，将1 μg RNA 按照说明书（美国Therm 公司）反转录为cDNA。根据实时荧光定量PCR 试剂盒SYBR Premix ExTaq TMⅡ（perfect real time）说明书（日本TakaRa 公司）进行，采用20 μL 的反应体系。 引物序列GAPDH 上游引物：5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'；下游引物：5'-AGTCCCCAAGTACCAAGTGC-3'；CCR6 上 游 引 物：5'-ATGGAGGTGGAAAGACAAG-3'；下游引物5'-CAGGGAAATCAAAGCAAA-3'。反应条件为95 ℃、30 s 预变性；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，总共40 个循环。mRNA 相对表达量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct 管家基因）实验-（Ct目的基因-Ct 管家基因）对照。采用仪器自带软件ABI Prism 7500 SDS 进行数据分析。

表1 3 组患者一般资料比较

1.2.2 血浆CCL20 和IL-17 水平检测 采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法（人CCL20 ELISA 试剂盒和IL-17 ELISA试剂盒为美国RayBiotech 公司产品）检测AMI 组、SAP 组和对照组患者血浆CCL20 和IL-17 水平。

1.2.3 冠脉狭窄严重程度评价 所有患者均在局麻下择期行冠脉造影，根据造影图像采用Gensini 评分评价冠脉狭窄严重程度[6]。Gensini 评分系统依据冠脉管腔狭窄程度进行定量评分：狭窄＜25%计1分；狭窄≥25%且＜50%计2 分，狭窄≥50%且＜75%计4 分，狭窄≥75%且＜90%计8 分，狭窄≥90%且≤99%计16 分，完全闭塞计32 分。再根据狭窄病变位于冠脉的不同部位确定相应系数：左主干病变×5；左前降支病变：近段×2.5，中段×1.5，远段×1；对角支病变：D1×1，D2×0.5；左回旋支病变：近段×2.5，钝缘支×1，远段×1；右冠脉病变：近、中、远和后降支均×1。每一冠脉的狭窄程度评分乘以该病变部位的系数，即为该病变血管的评分，各病变血管得分总和即为该患者的Gensini 评分。

1.2.4 随访 AMI 组患者出院后进行随访，根据最后一次就诊或最后一次电话随访结果确定终点。复合终点为主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events, MACE），包括全因死亡、心肌梗死、靶病灶血管重建、心力衰竭和复发性心绞痛。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 法；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组比较采用Kruskal-Wallis H 检验。计数资料组间比较采用χ2检验。采用Spearman 秩相关分析CCL20、CCR6、IL-17 与Gensini 评分的关系；采用ROC 曲线分析CCL20、CCR6、IL-17 对CAD 的诊断价值；采用二元logistic 回归分析CAD 的相关危险因素；采用Kaplan-Meier 生存曲线评估AMI 后不同CCL20 表达水平者生存率。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组患者PBMCs 中CCR6 mRNA 及血浆CCL20、IL-17 水平比较 SAP 组和AMI 组与对照组比较，CCR6 mRNA 的表达水平均上调（均P＜0.01），而AMI 组与SAP 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。SAP 组CCL20、IL-17 水平均高于对照组（均P＜0.01），SAP 组与AMI 组比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表2。

2.2 冠心病危险因素的logistic 回归分析 将年龄、糖尿病、高密度脂蛋白胆固醇、CCL20、IL-17 以及单因素方差分析有统计学意义的指标作为自变量。采用二元logistic 回归法筛选冠心病的独立危险因素。单因素分析显示吸烟、低密度脂蛋白胆固醇、CCL20、IL-17 水平为冠心病的危险因素，多因素分析显示CCL20、IL-17 水平为冠心病的独立危险因素（均P＜0.01），见表3。

2.3 CCR6 mRNA、CCL20 及IL-17 水平与冠脉狭窄程度的关系及对冠心病的诊断价值 相关性分析显示，CCR6 mRNA、CCL20 及IL-17 水平与Gensini评分均呈正相关（r=0.32、0.65、0.56，均P＜0.01）。ROC 曲线分析显示，CCL20、IL-17 对冠心病有较好的诊断价值，见图1、表4。

2.4 CCL20 水平对AMI 患者MACE 事件的预测价值 AMI 组共完成随访88 例，根据血浆CCL20 水平，采用二分法分为两组，截断值为185.4 pg/mL。Kaplan-Meier 生存曲线显示，CCL20 水平较高者生存时间低于CCL20 水平较低者，提示CCL20 水平与MACE 事件的发生率有关（r=0.540，P＜0.01）。CCL20 水平预测AMI 患者预后的ROC AUC 为0.812，表明CCL20 水平升高与MACE 发生率升高独立相关（P＜0.01），见图2。

表2 3 组患者PBMCs 中CCR6 mRNA 及血浆CCL20、IL-17 水平比较

表3 冠心病危险因素的logistic 回归分析

图1 CCL20、CCR6 mRNA 及IL-17 与冠脉狭窄程度关系的散点图及对冠心病诊断价值的ROC 曲线分析（a-c：CCL20、CCR6 mRNA 及IL-17与冠脉狭窄程度关系的散点图；d：CCL20、CCR6 mRNA 及IL-17 对冠心病诊断价值的ROC 曲线）

3 讨论

动脉粥样硬化是一种复杂的血管病理改变的过程，其主要特征是大量的驻留和适应性炎症细胞在动脉粥样硬化斑块内积聚。趋化因子在这些细胞迁移到炎症部位中发挥重要作用。

表4 CCL20、IL-17 对冠心病的诊断价值分析

CCL20-CCR6 轴已被证明对Th17 细胞有趋化作用，并在多种自身免疫性炎症疾病中调节IL-17的表达。CCL20 和CCR6 已被发现与动脉粥样硬化密切相关。Wan 等[7]发现CCL20 和CCR6 在小鼠正常主动脉和动脉粥样硬化斑块中表达，而在CCR6敲除ApoE-/-小鼠中，主动脉斑块面积较非敲除ApoE-/-小鼠显著减少30%~40%；同时，斑块中的巨噬细胞负荷显著降低44%。Manthey 等[8]发现，与CCR6+/+Ldlr-/-小鼠相比，CCR6 敲除Ldlr-/-小鼠的主动脉根部和主动脉粥样斑块负荷显著降低，巨噬细胞含量也显著降低。本研究发现，CCL20-CCR6 轴在CAD 患者中的表达明显高于非CAD 人群，且与CAD 的严重程度呈正比。Yilmaz 等[9]发现CCL20 和CCR6 在人颈动脉粥样硬化斑块中的表达显著升高，且与炎症细胞的浓度相关。Calvayrac 等[10]发现高脂血症患者外周血中CCL20 明显升高，且明显高于斑块病变处的分泌水平，提示血管内细胞是CCL20的主要分泌细胞。研究还发现低密度脂蛋白胆固醇可通过NF-κB 通路诱导血管平滑肌细胞分泌CCL20。Yan 等[11]发现CCL20-CCR6 轴可诱导γδT细胞向梗死心肌迁移，促使其分泌IL-17，IL-17 参与心肌梗死后心脏重构过程。我们的前期研究发现，AMI 患者PBMCs 中CCR6 阳性T 细胞计数升高，且与冠脉狭窄的严重程度呈正相关。

图2 CCL20 水平对AMI 患者MACE 事件的预测价值（a：CCL20 水平与生存率的Kaplan-Meier 曲线；b：CCL20 水平预测AMI 患者预后的ROC曲线分析）

基于上述炎症和免疫反应中趋化因子存在的证据，CCL20-CCR6 轴可能与冠心病，特别是与AMI密切相关。本研究同时检测了AMI、SAP、冠脉造影阴性3 组且有动脉粥样硬化疾病危险因素患者PBMCs 中CCR6 mRNA 表达水平和血浆CCL20 水平。AMI 和SAP 组CCR6 mRNA 和CCL20 水平均显著高于对照组。CCL20 水平与CCR6 mRNA 表达水平呈正相关。然而，AMI 组和SAP 组差异不显著。因此，CCL20-CCR6 轴可能参与了冠脉粥样硬化的慢性炎症过程，诱导各种炎症细胞在斑块内迁移积累，促进斑块进展。

Th17 细胞可通过诱导中性粒细胞炎症反应参与缺血性心脏病的进展。CCL20 是Th17 细胞最重要的趋化因子[12]。有证据表明，炎症性肠病中的CCL20-CCR6 轴可能通过影响Th17 和调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）细胞的比例来调节免疫应答[13-14]。Th17 细胞及其特异性分泌效应因子IL-17在急性冠脉综合征不稳定斑块中的作用仍存在争议。一项对85 例ACS 患者的研究显示，IL-17 水平较对照组升高，这一现象是由Th17 与Treg 功能失衡所致[15]。然而，一些关于白种人的研究得出了不同的结果。Patel 等[16]发现35 例ACS 白种人血清中IL-17 没有增加，可能是与种族差异、他汀类药物的使用和疾病的发病时间有关。但是，这些研究均不是前瞻性研究，都存在样本量小的局限性。最近，一项对981 例白种人进行的前瞻性研究确定了心肌梗死后循环血中IL-17 水平与心血管转归的关系，结果表明血清IL-17 水平是心肌梗死后2 年全因死亡率和心肌梗死复发的独立危险因素[17]。IL-17 水平越低，预后越差。低水平的IL-17 和高水平的可溶性血管细胞黏附分子-1 显著增加死亡和心肌梗死的风险。本研究证实，在中国人群中，血清IL-17 在冠心病患者中显著升高。IL-17 是一种多功能细胞因子，在动脉粥样硬化的不同阶段和一系列并发症中发挥着不同的作用。然而，其机制尚不清楚。

本研究进一步发现，CCL20-CCR6 轴和IL-17与病变数量和Gensini 评分呈正相关。ROC 曲线分析显示CCL20、IL-17 的AUC 分别为0.931、0.868。因此，CCL20 和IL-17 与冠脉狭窄程度密切相关，可能是诊断冠心病的有效血清学标志物。

CAD 危险因素的二元logistic 回归分析显示CCL20 和IL-17 水平是CAD 的独立危险因素。大量证据表明，斑块中巨噬细胞和T 细胞含量显著增加。CCL20 由这些炎症细胞分泌，并进一步招募单核细胞和炎症T 细胞在炎症部位聚集。分泌IL-17的炎症细胞反过来刺激涉及巨噬细胞和T 细胞的炎症免疫反应，并进一步分泌炎症因子，加剧斑块的不稳定性。Feldreich 等[18]证实CCL20 与慢性肾病3~5 期患者MACE 的危险因素有关。然而，关于AMI后CCL20 与MACE 之间关系的数据尚不充分。本研究的随访数据表明，AMI 患者CCL20 水平的升高与MACE 发生率的升高独立相关。因此，CCL20-CCR6 轴和IL-17 分泌等机制可能参与冠脉粥样硬化过程，CCL20 可能成为预防和治疗动脉粥样硬化进展的新靶点及AMI 预后的预测因子。