基于DNA甲基化与Aβ沉积探讨针刺治疗阿尔茨海默病的可能机制

柯 超，曹 洋，单生涛，夏叶婉，谭 艳，石文英，章 薇

(湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以进行性记忆力减退、认知功能障碍以及人格改变等症状为临床表现的一种常见的中枢神经系统退行性疾病[1]。近年来，其发病趋势越来越高，国际老年痴呆协会发布数据显示全球痴呆症患者，截至2015年已达4 680万，至2050年患者人数预计将达1.315亿[2]。其所带来的经济负担也不容小觑，中国在全球痴呆症总成本中所占比例很高[3]，2015年、2020年、2030年、2040年和2050年，中国分别占全球痴呆症总成本的17.52%、18.71%、20.00%、20.80%和20.70%，预计2050年我国阿尔茨海默病的直接经济负担将达7 453.21亿元/年[4]。

阿尔茨海默病归属于中医“痴呆”“善忘”“健忘”“多忘”“好忘”“善误”“忘事”与“呆病”等。清代汪昂《医方集解·补养之剂》曰：“人之精与志皆藏于肾，肾精不足则志气衰，不能上通于心，故迷惑善忘也。“若先天不足或后天失养，致使肾精不足，则不能生髓充盈，髓海空虚，脑髓失充，元神失养，故表现为头晕目眩、耳鸣如蝉和记忆力减退，最终导致疾病的发生。魏江平等[5]认为“阳化气，阴成形”的功能异常贯穿痴呆的整个过程，是痴呆病机核心。随着年龄增长，各个脏腑阴阳逐渐衰退，阳不可化气，阴不可成形，在此基础上生成痰浊、瘀血等病理产物，最终瘀阻脑络、痰瘀化火、神明被扰和脑髓渐空，最终形成痴呆。故而，痴呆发病的病位在脑，与五脏相关[6]，考虑本病病机属本虚标实，以五脏虚损为本，痰浊瘀血为标，虚实夹杂，最终导致神机运转不利，发生痴呆，故而治疗上应从五脏着手，从整体水平对该病进行考量，实施综合治疗[7]。

针灸治疗AD具有早期性、安全性、功能性与良性双向调整的优势[8]，且针刺对AD的确切疗效主要是通过多种途径发挥治疗作用：抑制Aβ淀粉样蛋白过度沉积、抑制Tau蛋白过度磷酸化、调节神经递质的释放、提高自噬、提高载脂蛋白E表达、调控能量代谢、抑制细胞凋亡、抗氧化应激、调控小胶质细胞的生理病理状态、提高雌激素水平、改善免疫系统、改善胰岛素抵抗、提高神经营养因子含量、激活海马蛋白激酶和抑制中枢神经炎性与改善突触可塑性等[9-11]。针刺治疗AD的机制较为复杂，表观遗传修饰可能参与其中，Aβ过度沉积是AD发病的重要病理特征之一，但是目前相对于表观遗传学机制这块探讨不多，故而笔者就表观遗传学中的DNA甲基化对针刺治疗阿尔茨海默病Aβ过度沉积这一病理环节的可能机制研究进行探讨，综述如下。

1 DNA甲基化

1.1 DNA甲基化定义

表观遗传是指不改变基因序列，对基因进行可逆性的修饰从而改变基因的表达。DNA甲基化、组蛋白共价修饰和RNA编辑等均属于表观遗传的方式。其在AD发病中也发挥着重要的作用，涉及到AD多个环节：AD中的记忆缺失、淀粉样前体蛋白水解(APP)、Aβ淀粉样斑块形成、Tau蛋白磷酸化、氧化应激、细胞凋亡与线粒体功能障碍等[2]。其中，DNA甲基化是目前最具特征、研究最多和最为常见的表观遗传修饰，在AD发病过程中起着相当重要的作用[12]。研究表明，DNA甲基化与AD的学习记忆能力、淀粉样斑块形成和磷酸化Tau蛋白形成等多环节相关。DNA甲基化是指经过DNA甲基转移酶(DNMT)介导作用，在基因启动子中CpG岛胞嘧啶的5位碳原子上加入一个甲基基团，阻碍转录因子和启动子的结合，抑制基因转录，达到介导基因沉默的目的。

1.2 参与DNA甲基化调控的物质

在DNA甲基化的过程中，DNMT、MeCP2及SAM/SAH参与DNA甲基化的调控。SAM为甲基供体，可以在DNMT的作用下，去掉一个甲基就转变为SAH，去掉的甲基参与DNA甲基化过程，SAH会进一步形成同型半胱氨酸(Hcy)，Hcy在接受5-甲基四氢叶酸后会共同合成蛋氨酸，继而又转化成SAM，如此循环。若SAM/SAH比率降低，会损害细胞DNA、RNA、组蛋白和细胞核受体辅助调节因子的甲基转移反应[3]。也就是说，SAM是DNA甲基化过程中甲基的主要来源，SAM/HCY循环是体内的甲基循环途径。

DNMT是参与DNA甲基化的主要酶，可以将SAM上的甲基转移到胞嘧啶上，由此形成5甲基胞嘧啶。DNMTs家族包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a及DNMT3b等。DNMT3a的表达与神经退行性疾病有密切关联[4]，DnMT3a和3b负责DNA的从头甲基化[13]，而DNMT1是维持甲基化酶[14]。有研究显示[15]DNMT3a优先参与维持甲基化，使胞嘧啶半甲基化，然后由DNMT1和MeCP2作用，以确保基因的完全抑制。因此，DNMT3a的任何改变最终都会导致低甲基化，从而激活特定的靶基因。

甲基结合蛋白(MBDs)是连接DNA甲基化和组蛋白修饰的关键蛋白。MBD蛋白家族主要有5个成员，包括MBD1、MBD2、MBD3、MBD4以及MeCP2(甲基CpG蛋白2)[16]。该蛋白在成熟神经元中的大量存在表明，它对神经元的功能特别重要，MeCP2具有转录激活子和抑制子的双重作用[17]，在神经系统中，MeCP2主要是通过转录抑制子发挥作用。MeCP2优先结合到甲基化DNA位点，作为转录抑制因子与神经细胞特异性基因启动子发生特异性结合，并对其产生负性调节作用。

1.3 DNA甲基化的发生位点

DNA甲基化主要发生在CpG岛和启动子区，当DNA甲基化发生在启动子区域，其转录水平通过两种途径影响：①由于该区域DNA的甲基化转录因子不能结合基因启动子，即启动子区域被甲基所占领，故而不能结合转录因子，转录受到抑制;②甲基CpG结合蛋白结合这些甲基化的DNA序列，即启动子区域被甲基结合蛋白所占领，不能结合转录因子，转录受到抑制。最终，高甲基化抑制基因的表达，低甲基化则促进基因的表达。见图1。

2 Aβ沉积与DNA甲基化异常修饰

2.1 Aβ沉积是引起AD病理损伤的中心环节

目前AD的发病机制尚未清楚，存在多种假说，而各种假说的形成与既有假说的完善，使AD形成机制倾向具有复杂、系统和多元的特点，而逐步放弃单一因素致病的观点。目前较为多见的假说是β淀粉样蛋白假说/Aβ瀑布假说，其主要认为：β-淀粉样蛋白积累所形成的老年斑(SP)是目前公认的AD主要的病理学特征之一，研究认为Aβ沉积是引起AD病理损伤的中心环节。Aβ的产生和清除在正常情况下处于动态平衡中，病理情况下，Aβ的生成与清除失衡可导致细胞外Aβ过度沉积，聚集为具有神经毒性的SP，进一步导致神经元变性、坏死；与此同时，星形胶质细胞(MG)、小胶质细胞(AS)可被Aβ激活，神经炎性因子可被Aβ诱导产生，如IL-1β、IL-6、TNF-α及INF-γ等，从而引发一系列炎症反应，促进AD进展；此外，Aβ在聚集过程中会诱发氧化应激反应，诱导神经元凋亡[18]；Aβ能促进隔-海马胆碱能神经系统损害[19]；Aβ过量表达会促进神经纤维缠结NFT形成，导致Tau蛋白高磷酸化[20]。由此可见，沉积的Aβ可通过各种途径直接或间接地促进AD的发展。

2.2 Aβ生成和清除失衡导致Aβ沉积

Aβ生成和清除主要是通过如下途径,淀粉样前体蛋白(APP)是Aβ的前体物质，生理状态下，APP主要通过非淀粉样蛋白生成途径代谢，先由α-分泌酶切割，再经过γ-分泌酶切割，生成无毒性的P3肽和APP胞内结构域(AICD)，释放到细胞质的AICD片段被蛋白酶降解。病理状态下，APP通过淀粉样蛋白生成途径代谢，先由β-分泌酶(BACE1)切割，再经过γ-分泌酶(PS1、PS2)切割，生成不同长度的Aβ片段和AICD[21]。Aβ在体内的清除途径包括中枢清除和外周清除，中枢清除是主要清除途径，包括: 蛋白酶的降解作用、细胞的清除作用、血脑屏障的转运作用、脑脊液和组织间液淋巴引流作用。其中，蛋白酶的降解作用占据主导地位，尽管Aβ可以被大脑中多种蛋白酶代谢，但是仍有相当数量的Aβ以完整形式存在。因此，Aβ的另一清除途径也值得关注，即细胞清除，细胞内Aβ降解主要在溶酶体中进行，Aβ被小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元等细胞摄取内化后，通过溶酶体中的组织蛋白酶降解[22]。

2.3 DNA甲基化参与Aβ相关基因的调控

研究表明，DNA甲基化在脑衰老和AD中起关键作用[23]，AD与基因组的整体低甲基化有关[24]。同时发现基因组DNA的胞嘧啶甲基化随着年龄的增长而减少，也就是说表观遗传因素在衰老过程的神经系统疾病中具有重要的作用。对AD患者皮层组织神经元进行尸检，发现患者5-甲基胞嘧啶(5mC)的免疫反应性明显低于同年龄正常对照组。同一神经元中，5mC的水平也与晚期神经纤维缠结的标志物呈负相关，提示5mC的显著损失发生在AD大脑中[25]。

前期研究证明，异常的DNA甲基化可能增加Aβ的沉积，APP、BACE1及PS1(γ分泌酶的活性中心)受到DNA甲基化的调节。West等首次报道AD患者脑中APP启动子会发生低甲基化[26]，PS1和BACE1基因启动子低甲基化也促进了Aβ的生成[27]。体内研究发现，APP过表达的转基因小鼠以缺乏叶酸的食物喂养后，BACE1、PS1启动子区低甲基化，表达上调从而造成Aβ生成增多[28]，即通过DNA甲基化循环途径来参与AD的病理过程。更有研究发现Aβ聚集会促进隔-海马胆碱能神经系统损害，引起细胞内广泛低甲基化，并提高NEP启动子甲基化，形成一定的恶性循环，同时AD的发生与APOE的超甲基化密切相关[29]。基于这些研究发现，已经确定在Aβ生成相关基因，例如：PS1、BACE和APP基因中，DNA甲基化降低，从而促进转录过程，促进了Aβ生成；在Aβ清除相关基因，例如：NEP、APOE基因中，DNA甲基化增高，从而抑制转录过程，抑制了Aβ清除，最终增强了Aβ沉积。黄珮戎[30]研究发现AMPO模型中表观遗传机制调控了RPE细胞分泌Aβ增多，该模型中甲基转移酶表达减少，BACE1基因启动子低甲基化，Aβ生成增多。姜黄素能通过诱导阿尔茨海默病细胞模型中NEP基因DNA发生去甲基化，从而上调NEP的mRNA及蛋白水平[31]。

3 针刺治疗阿尔茨海默病的DNA甲基化机制

3.1 针刺可有效治疗AD

有学者对1 324项AD临床研究中的77项随机对照试验进行Meta分析提示针灸治疗AD具有良好的临床优势[32]，具有早期性、安全性、功能性和良性双向调整的优势。现有研究均已经证实针刺治疗AD并非只通过某一种作用机制来实现，而是通过多靶点多途径干预实现[33-34]：减少Aβ沉积、抑制Tau蛋白过度磷酸化、调节胆碱能系统、抑制神经元凋亡、减轻氧化应激、调节能量代谢、调节神经递质、缓解免疫炎性反应、调节金属离子代谢及减少线粒体损伤等方面，这与中医所强调的整体观念及综合调治相呼应。就减少Aβ沉积这一机制而言，针刺能够调节 Aβ 的生成与代谢，减低有关脑区Aβ水平。电针可有效降低 AD模型小鼠大脑皮层和血清中的 Aβ1-40和Aβ1-42水平，改善学习记忆能力[35]。杨文丹[36]研究发现电针能够显著减低APP/PSl模型小鼠海马APP、BACE1表达，同时提升催化Aβ降解的水解酶IDE水平，减少海马区SP的沉积。罗磊等[37]研究显示针灸可降低AD大鼠血清内Aβ含量，使大鼠海马区两种Aβ降解酶——NEP和PREP的表达显著增加，从而延缓AD的病理进程。

3.2 针刺可参与DNA甲基化调控

表观遗传对其所致的疾病具有可逆性[38]，针灸可通过调控表观遗传修饰治疗缺血性脑卒中[39]、肝癌[40]等疾病。研究表明，针刺可降低坐骨神经结扎诱导的额叶皮层中MeCP2和DNMT酶水平，逆转整体DNA甲基化的下降，从而缓解慢性疼痛[41]。电针可以降低多囊卵巢综合征模型大鼠下丘脑中的整体DNA甲基化水平和DNMT3b的表达[42]。电针治疗慢性传输型便秘大鼠可以增加结肠组织中GDNF启动子区的CpG水平，降低甲基化水平[43]。电针慢性不可预知性应激诱导的抑郁大鼠可升高海马DNMT3L基因的mRNA水平、降低MBP基因的mRNA水平，考虑这可能有Dnmt3L基因和MBP基因表观调节变化[44]。

3.3 针刺可能通过调控DNA甲基化减少Aβ沉积

针灸可通过调控表观遗传修饰治疗多种疾病，那么针刺是否是通过表观遗传修饰中的DNA甲基化途径来治疗AD的病理环节——Aβ沉积，有待继续观察。目前，有研究发现预电针和预针刺可上调细胞核中DNMT1蛋白表达水平，可显著上调D-半乳糖诱导的AD样病理大鼠中缝背核区GSK3β基因启动子区CpG岛甲基化水平，抑制GSK3β基因的转录和表达[45]。马冉[46]发现电针可升高SAMP8小鼠海马组织CDK5基因启动子区甲基化水平，上调DNMT1的表达，从而抑制tau蛋白过度磷酸化。可见，针刺可通过调控AD发病的其他病理环节的DNA甲基化修饰途径来治疗该病，但是尚未有研究探索针刺是否通过DNA甲基化修饰途径来治疗Aβ沉积，有待进一步完善。

4 结语

近年来，针对针灸通过调控表观遗传修饰治疗AD的研究也逐渐增多，为针灸治疗AD的作用机制提供了新的思路和研究方向。DNA甲基化作为最具特征、研究最多与最为常见的表观遗传修饰途径，在AD发病过程中起着相当重要的作用。而Aβ沉积是引起AD病理损伤的中心环节，DNA甲基化修饰异常即可影响Aβ相关生成或者清除基因的表达，从而影响其转录和表达。那么，针刺作为一种治疗AD的有效方式，目前认为其治疗AD可通过多靶点多途径发挥作用，前期研究发现针刺可通过参与甲基化的调控来参与诸多疾病的治疗，那么针对于Aβ沉积这一AD的病理环节，关于DNA甲基化与针刺治疗AD大鼠Aβ相关基因调控的研究比较少，其具体机制尚不清楚，针刺是否通过DNA甲基化修饰途径来减少Aβ沉积有待深入研究。

笔者认为后续可以充分利用分子生物学技术探讨电针对AD大鼠Aβ沉积调控机制的影响,从分子水平探究Aβ相关基因的表达及其参与诱导Aβ相关基因的调控机制，更加全面系统地揭示针灸干预AD的作用机制的科学内涵, 为临床运用针灸防治AD提供更加夯实的实验依据，阐明其疗效机制。与此同时，在导致AD发病的一些病理过程中，DNA高甲基化和低甲基化是并存的，往往并非独立存在，同时其过程可能涉及到复杂因子和信号通路，那么如何提高相关基因的甲基化和降低相关基因的甲基化水平，如何进行基因特异性的针刺治疗，将DNA甲基化调控在一个适度的水平来防治AD也是一个值得思考的难题，有待进一步研究。然而，尽管目前面临诸多难题，需要探究更特异的靶点，但不可否认，从DNA甲基化角度探究有望成为AD治疗的发展方向，且随着现代技术的提升，相信其会有更好的发展趋势。