阴地翠雀花的化学成分研究

郭秋菊，杨传轮，陈 琳，黄 帅，郭春生，张纯姑*

1西南交通大学生命科学与工程学院；2西南交通大学物理科学与技术学院，成都 610031；3黄河三角洲京博化工研究院有限公司，滨州 256500

翠雀属(Delphinium)为毛茛科(Ranuculaceae)多年生或一、二年生草本植物，在全球约有300种，广泛分布于北半球地区，我国有近220种[1]。在我国，翠雀属多种植物具有悠久的药用历史，可治疗跌打损伤、风湿、牙痛和肠炎等疾病[2]。二萜生物碱是一类结构复杂的天然产物，广泛存在于翠雀属植物中，基本骨架主要分为C18-、C19-和C20-二萜生物碱[3]；现代药理研究表明二萜生物碱具有抗炎、镇痛、抗肿瘤和抗心律失常等药理活性[4]。有研究证明乌头碱型C19-二萜生物碱forrestline F，以及阿替生型C20-二萜生物碱songorine具有一定的抗炎活性[5,6]；牛扁碱型C19-二萜生物碱delbrunine和delpheline，以及阿替生型C20-二萜生物碱delphatisine C具有一定的抗肿瘤活性[7]。阴地翠雀花(DelphiniumumbrosumHand.-Mazz.)为毛茛科翠雀属植物，产于云南西北部(中甸至德钦一带)，生长在海拔3 500～3 900 m间山地草坡或林下[8]。目前，未见阴地翠雀花的化学成分及生物活性研究报道。因此，为了补充阴地翠雀花的研究空白，为其开发利用提供理论指导。本文对阴地翠雀花的生物碱成分进行系统研究，并测试了部分化合物对脂多糖诱导小鼠RAW 264.7巨噬细胞产生NO的抑制作用，以及所有化合物对小鼠乳腺癌4T1细胞的抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂

核磁共振波谱仪(Bruker AV 400和600，TMS为内标，CDCl3为溶剂)；超高效液相色谱(ACQUITY UPLCI-Class)与四级杆飞行时间质谱(Xevo G2-S QTof)联用仪(Waters 公司)；RE-2000A 旋转蒸发仪(上海亚荣)；ZF-20C 紫外光谱仪、电子分析天平(托利多上海仪器有限公司)。薄层层析硅胶 GF254(青岛海洋化工厂)；柱层析硅胶G和H(200～400目，青岛海洋化工厂)；显色剂为改良碘化铋钾溶液和碘蒸气；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、二乙胺等试剂均为分析纯。

全自动酶标仪(Molecular仪器公司)；CO2培养箱(Panasonic公司)；旋涡混合器(金怡仪器科技有限公司)；脱色摇床仪(百岛生物公司)；显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)。培养基、胎牛血清和脂多糖(Natocor公司)；RAW 264.67细胞(ATCC 细胞库)；NO检测试剂盒(碧云天生物公司)。

1.1.2 实验药材

所使用的阴地翠雀花样品于2020年8月采自云南省迪庆州香格里拉市虎跳峡镇，经云南中医学院李国栋副教授鉴定为阴地翠雀花(DelphiniumumbrosumHand.-Mazz.)，标本(2020HS00002)留存于西南交通大学生命科学与工程学院。

1.2 方法

1.2.1 提取与分离

将干燥的阴地翠雀花全草部分(10.0 kg)，粉碎后用95%乙醇浸提5天(4次)，回收滤液、减压浓缩得总浸膏1.2 kg，用温水溶解浸膏后，加入稀释的盐酸水溶液，调节pH至2～3，用石油醚(4.0 L)萃取4次，萃取液进行减压浓缩。随后水层用氨水调节pH至9～10，二氯甲烷萃取至无生物碱，减压浓缩萃取液，得总生物碱73.0 g。

阴地翠雀花的总生物碱经正相硅胶柱层析初步分离，选用洗脱剂(二氯甲烷∶甲醇100∶1→0∶1)进行梯度洗脱，得到A～D四个部分。B部分通过硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺50∶1∶0.03→0∶1∶0.03)洗脱得到B1和B2两个部分。B1部分通过硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯30∶1→0∶1)梯度洗脱，得到B1-1、B1-2和B1-3三个部分；B1-2部分通过硅胶柱层析(石油醚∶二乙胺15∶1→4∶1)梯度洗脱，得到化合物14(120.0 mg)；B1-3部分通过硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇80∶1→10∶1)梯度洗脱，得到化合物4(13.0 mg)，化合物5(19.0 mg)，化合物11(230.0 mg)和化合物12(50.0 mg)。B2部分通过硅胶柱层析(石油醚∶二乙胺20∶1→0∶1)梯度洗脱，得到化合物6(16.0 mg)。C部分通过硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇60∶1→0∶1)洗脱得到C1、C2、C3和C4四个部分。C1部分经硅胶柱层析(石油醚∶二乙胺15∶1→3∶1)洗脱得到化合物10(180.0 mg)；C2部分通过硅胶柱层析(乙酸乙酯∶二乙胺50∶1→8∶1)梯度洗脱得到化合物2(140.0 mg)和化合物9(50.0 mg)；C3部分经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺30∶1∶0.1→0∶1∶0.1)洗脱得到化合物1(113.0 mg)；C4部分通过硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇40∶1→5∶1)梯度洗脱得到化合物3(6.0 mg)。D部分通过硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇70∶1→0∶1)洗脱得到D1、D2和D3三个部分。D2部分通过硅胶柱层析(乙酸乙酯∶二乙胺40∶1→5∶1)洗脱得到化合物7(22.0 mg)和化合物13(6.0 mg)；D3部分通过硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺30∶1∶1→5∶1∶1)洗脱得到化合物8(287.0 mg)。

1.2.2 体外抗炎活性测试

采用MTT法测定所有化合物对小鼠单核巨噬RAW 264.7细胞的存活率[9]。将RAW 264.7细胞以100 μL/孔(每孔含6×103个细胞)接种至96板孔中培养12 h。加入含药培养基(40 μmol/L，100 μL/孔)，正常组和空白组加入含1% DMSO的培养基(100 μL/孔)培养24 h后，加入5 mg/mL MTT(20 μL/孔)培养4 h，弃去上清液，加入DMSO(150 μL/孔)，摇床震荡10 min后，采用酶标仪在492 nm处读取吸光值(A)。

细胞存活率=

[(A样品-A空白)/(A正常对照-A空白)]×100%

采用Griess法考察部分化合物的抗炎活性，测定其对由脂多糖诱导的小鼠单核巨噬RAW 264.7细胞炎症的抗炎作用[10,11]，以塞来昔布(10 μmol/L)为阳性对照。将RAW 264.7细胞以100 μL/孔(每孔含2×104个细胞)在96板孔中培养12 h，用LPS(1 μg/mL)和含药培养基(40 μmol/L，100 μL/孔)预处理24 h，模型组与空白组加入培养基。按NO试剂盒说明书进行操作，并用酶免疫测定仪在540 nm处测量吸光值(A)。

NO生成抑制率=

[(A模型-A样品)/(A模型-A空白)]×100%

1.2.3 体外抗肿瘤活性测试

采用MTT法测定化合物对小鼠乳腺癌4T1细胞的生长抑制率[12,13]，以紫杉醇(10 μmol/L)为阳性对照。将4T1细胞以100 μL/孔(每孔含2×104个细胞)在96板孔中培养12 h，加入含药培养基(40 μmol/L，100 μL/孔)，正常组和空白组加入含1% DMSO的培养基(100 μL/孔)培养24 h，于96板孔中重新加入5 mg/mL MTT(20 μL/孔)和培养基培养4 h，弃去上清液，加入DMSO(150 μL/孔)，摇床震荡10 min后，采用酶标仪在492 nm处读取吸光值(A)。

细胞生长抑制率=

[(A正常对照-A样品)/(A正常对照-A空白)]×100%

2 实验结果

2.1 结构鉴定

图1 化合物1～14的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-14

化合物8白色无定形粉末，碘化铋钾溶液呈阳性反应；HR-ESI-MS：m/z700.381 8 [M+H]+(calcd for C37H54N3O10，700.380 9)，分子式C37H53N3O10。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.05/11.15(1H，br s，NH)，7.09～8.68(4H，m，Ar-H)，3.59(1H，t，J=4.8Hz，Hβ-14)，3.38，3.36，3.32，3.24(各3H，s，4×OMe)，1.04(3H，t，J=7.2Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：84.0(d，C-1)，26.1(t，C-2)，32.3(t，C-3)，37.6(s，C-4)，43.3(d，C-5)，91.0(d，C-6)，88.6(s，C-7)，77.6(s，C-8)，50.5(d，C-9)，38.1(d，C-10)，49.1(s，C-11)，28.7(t，C-12)，46.1(d，C-13)，84.0(d，C-14)，33.7(t，C-15)，82.6(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.9(t，C-18)，52.4(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.2/14.3(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，57.9(q，6-OCH3)，58.2(q，14-OCH3)，56.4(q，16-OCH3)，168.0(s，OCOAr)，115.0(s，C-1′)，141.8(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，134.9(d，C-4′)，122.8(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，173.9/170.7(s，C-1′′)，39.5/42.0(d/t，C-2′′)，39.2/36.5(t/d，C-3′′)，174.8/178.1(s，C-4′′)，18.2/17.8(q，C-5′′)。以上数据与文献报道[21, 22]基本一致，故鉴定化合物8为一对区域异构体，德尔色明A和B。

化合物9白色无定形粉末，碘化铋钾溶液呈阳性反应;HR-ESI-MS：m/z701.365 8 [M+H]+(calcd for C37H53N2O11，701.364 9)，分子式C37H52N2O11。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：10.97/11.05(1H，br s，NH)，7.06～8.73(4H，m，Ar-H)，3.38，3.34，3.32，3.23(各3H，s，4×OCH3)，1.04(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：83.9(d，C-1)，26.2(t，C-2)，32.3(t，C-3)，37.6(s，C-4)，43.3(d，C-5)，91.0(d，C-6)，88.6(s，C-7)，76.6(s，C-8)，50.5(d，C-9)，38.2/37.9(d，C-10)，49.1(s，C-11)，28.7(t，C-12)，46.2(d，C-13)，84.0(d，C-14)，33.8(t，C-15)，82.6(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.5/69.8(t，C-18)，52.4/53.5(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.2(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，57.9(q，6-OCH3)，58.1(q，14-OCH3)，56.4(q，16-OCH3)，168.0/167.9(s，OCOAr)，114.6(s，C-1′)，142.0/142.3(s，C-2′)，120.5(d，C-3′)，134.9(d，C-4′)，122.4/122.3(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，171.8(s，C-1′′)，42.0/38.6(t/d，C-2′′)，37.9/41.4(d/t，C-3′′)，177.8/176.0(s，C-4′′)，18.1/18.2(q，C-5′′)。以上数据与文献报道[21]基本一致，故鉴定化合物9为一对区域异构体，delavaine A free acid和delavaine B free acid。

化合物10白色无定形粉末，碘化铋钾溶液呈阳性反应;HR-ESI-MS：m/z715.378 7 [M+H]+(calcd for C38H55N2O11，715.380 6)，分子式C38H54N2O11。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.15/11.03(1H，br s，NH)，7.09～8.69(4H，m，Ar-H)，3.39，3.37，3.33，3.25(各3H，s，4×OCH3)，1.05(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：84.0(d，C-1)，26.2(t，C-2)，32.3(t，C-3)，37.6(s，C-4)，43.3(d，C-5)，91.0(d，C-6)，88.6(s，C-7)，77.6(s，C-8)，50.5(d，C-9)，38.2(d，C-10)，49.2(s，C-11)，28.8(t，C-12)，46.2(d，C-13)，84.0(d，C-14)，33.8(t，C-15)，82.6(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.8(t，C-18)，52.5(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.2(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，57.9(q，6-OCH3)，58.2(q，14-OCH3)，56.4(q，16-OCH3)，168.1(s，OCOAr)，114.8/114.7(s，C-1′)，142.0/141.7(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，135.0(d，C-4′)，122.6(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，172.6/170.0(s，C-1′′)，41.5/39.1(t/d，C-2′′)，39.1/37.6(d/t，C-3′′)，174.2/176.1(s，C-4′′)，18.0/17.2(q，5′′)，51.8/52.1(q，C-6′′)。以上数据与文献报道[23]基本一致，故鉴定化合物10为一对区域异构体，德拉瓦印A和B。

化合物11白色无定形粉末，碘化铋钾溶液呈阳性反应;HR-ESI-MS：m/z729.397 8 [M+H]+(calcd for C39H57N2O11，729.396 2)，分子式C39H56N2O11。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.14/11.02(1H，br s，NH)，7.08～8.70(4H，m，Ar-H)，3.39，3.36，3.32，3.24(各3H，s，4×OCH3)，1.05(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：82.7(d，C-1)，26.2(t，C-2)，32.3(t，C-3)，37.7(s，C-4)，43.4(d，C-5)，91.1(d，C-6)，88.6(s，C-7)，77.6(s，C-8)，50.6(d，C-9)，38.2(d，C-10)，49.2(s，C-11)，28.8(t，C-12)，46.2(d，C-13)，84.0(d，C-14)，33.8(t，C-15)，82.7(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.9/69.8(t，C-18)，52.5(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.1(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，57.9(q，6-OCH3)，58.2(q，14-OCH3)，56.4(q，16-OCH3)，168.1(s，OCOAr)，114.8(s，C-1′)，141.8/142.0(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，135.0(d，C-4′)，122.6(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，172.1/170.1(s，C-1′′)，39.2/41.6(d/t，C-2′′)，38.0/36.1(t/d，C-3′′)，174.3/175.6(s，C-4′′)，18.0/17.2(q，5′′)，60.7(t，C-6′′)，14.2(q，C-7′′)。以上数据与文献报道[24]基本一致，故鉴定化合物11为一对区域异构体，拉翠碱A和B。

化合物12白色无定形粉末，碘化铋钾溶液呈阳性反应;HR-ESI-MS：m/z729.359 1 [M+H]+(calcd for C38H53N2O12，729.359 9)，分子式C38H52N2O12。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.05(1H，br s，NH)，7.09～8.68(4H，m，Ar-H)，3.41，3.36，3.23(各3H，s，3×OCH3)，1.06(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：83.8(d，C-1)，25.9(t，C-2)，32.0(t，C-3)，37.7(s，C-4)，50.2(d，C-5)，90.8(d，C-6)，88.5(s，C-7)，77.3(s，C-8)，43.6(d，C-9)，45.7(d，C-10)，49.0(s，C-11)，28.2(t，C-12)，37.9(d，C-13)，74.8(d，C-14)，33.1(t，C-15)，83.3(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.8(t，C-18)，52.5(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.1(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，58.3(q，6-OCH3)，57.9(q，16-OCH3)，168.1(s，OCOAr)，114.8(s，C-1′)，141.6(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，135.0(d，C-4′)，122.8(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，170.4(s，C-1′′)，41.3(t，C-2′′)，36.0(d，C-3′′)，179.8(s，C-4′′)，17.1(q，C-5′′)。以上数据与文献报道[25]基本一致，故确定该化合物为umbrosumine C。

化合物13白色无定形粉末，碘化铋钾溶液呈阳性反应;HR-ESI-MS：m/z728.375 8 [M+H]+(calcd for C38H54N3O11，728.375 8)，分子式C38H53N3O11。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：11.18/11.07(1H，br s，NH)，7.12～8.70(4H，m，Ar-H)，3.43，3.38，3.25(各3H，s，3×OCH3)，1.07(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：84.0(d，C-1)，26.1(t，C-2)，31.6(t，C-3)，37.8(s，C-4)，50.5(d，C-5)，91.0(d，C-6)，88.7(s，C-7)，77.4(s，C-8)，43.7(d，C-9)，45.9(d，C-10)，49.1(s，C-11)，28.2(t，C-12)，37.9(d，C-13)，74.8(d，C-14)，33.2(t，C-15)，83.4(d，C-16)，64.6(d，C-17)，70.0(t，C-18)，52.5(t，C-19)，51.2(t，C-21)，14.2(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，58.3(q，6-OCH3)，57.9(q，16-OCH3)，170.9(s，14-OCOCH3)，168.1(s，OCOAr)，115.1(s，C-1′)，141.8(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，135.0(d，C-4′)，122.8(d，C-5′)，130.5(d，C-6′)，174.8(s，C-1′′)，42.1/39.6(t/d，C-2′′)，36.5/39.3(d/t，C-3′′)，177.8/173.7(s，C-4′′)，17.9/18.4(q，C-5′′)。以上数据与文献报道[26]基本一致，故鉴定化合物13为一对区域异构体，umbrosumines A和B。

2.2 结构鉴定分析

经结构鉴定，确定以上化合物8、9、10、11、13均为一对区域异构二萜生物碱的混合物，二者碳谱十分相似，主要区别在于苯环侧链的甲基连接位置不同，分别连接在C-2′′和C-3′′位，进而导致C-2′′和C-3′′位的化学位移及峰型发生了变化，两者峰型相反。化合物8中区域异构体的比例可由氢谱11 ppm处NH的积分比例呈现，其比例为3∶1，由于甲基(C-5′′)连接位置的变化[CH3(C-2′′→C-3′′)]，导致化合物8中区域异构体的C-2′′、C-3′′的峰型截然相反，由此确定化合物8为一对区域异构二萜生物碱的混合物。同理，确定化合物9、10、11、13也均为一对区域异构二萜生物碱，其比例分别为1.7∶1、1.2∶1、1.6∶1及1.3∶1。

2.3 活性测试结果

化合物浓度在40 μmol/L时，测试了化合物(3～8、10～13)对脂多糖诱导小鼠RAW 264.7巨噬细胞产生NO的抑制作用，以及化合物(1～14)对小鼠乳腺癌4T1细胞的抗肿瘤作用，结果显示所有测试化合物均无明显抗炎及抗肿瘤活性。

3 结论

本研究对阴地翠雀花全草进行了生物碱成分的研究，共分离得到14个生物碱，其中包括13个牛扁碱型C19-二萜生物碱，1个异喹啉类生物碱，化合物1～14均为首次从该植物中分离得到。本研究补充了阴地翠雀花的研究空白，为其植物化学分类提供了参考依据，为后续寻找活性生物碱成分提供了物质基础。测试了化合物对小鼠RAW 264.7巨噬细胞的抗炎作用，以及对小鼠乳腺癌4T1细胞的抗肿瘤作用，结果表明所有测试化合物均无明显抗炎及抗肿瘤活性。