基于图像拼接方法对不同程度干眼症患者角膜上皮基底神经丛的定量分析

高欢 于花 郑晓汾 赵炬伟 宁晓玲 马骎 侯康

干眼症是指由泪液的质和（或）量及泪液动力学异常导致的泪膜稳定性下降、眼表稳态失衡，进一步引起眼部损伤和不适的一类疾病[1-3]，主要表现为眼部干涩、异物感、畏光、易视疲劳等，严重者甚至可能影响视力。除了眼表的炎症反应及组织损伤外，干眼症患者可同时伴有眼表神经的异常改变。多项研究表明干眼症的发生发展和角膜神经息息相关，但对于其具体变化规律的了解却相对较少且争议较大[4-8]。当前关于活体角膜神经的分析主要依靠角膜共聚焦显微镜（In-vivo confocal microscopy，IVCM），大多数研究通过选取一定数量互不重叠的图像进行综合分析，但是受IVCM观察范围小、定位功能差、不同部位角膜神经分布差异大、研究结果分析主观性强等特点，此方法对于病情评估往往存在较大的偏差。本课题组前期研究证实通过构建角膜上皮基底细胞层下神经丛（Subbasal epithelial nerve plexus，SNP）结构拼图在分析SNP形态学信息及提高其测量的重复性和精确性等方面较传统的多张图片分析法更具优越性，在研究中具有独特的优势[9]。基于此，本研究拟通过拼图法（Photoshop CC 2018）构建不同程度干眼症患者角膜SNP结构拼图，并通过Image J软件对不同程度干眼症患者角膜SNP进行定量分析，探讨其变化规律，希望为干眼症的多样化诊断和治疗提供思路。

1 对象与方法

1.1 对象

纳入标准：（1）根据2020年干眼临床诊疗专家共识中提到的干眼诊断标准[2]：①患者主诉有眼部干涩感、异物感、烧灼感、疲劳感、不适感、眼红、视力波动等主观症状之一，中国干眼问卷量表≥7分或眼表疾病指数（Ocular surface disease index，OSDI）≥13分；同时，患者荧光素染色泪膜破裂时间（Tear breakup time，TBUT）≤5 s或非侵入性泪膜破裂时间（Non-invasive breakup time，NIBUT）＜10 s或泪液分泌试验（Schirmer I test，SⅠt）（无麻醉）≤5 mm/5 min，可诊断干眼。②患者有干眼相关症状，中国干眼问卷量表≥7分或OSDI≥13分；同时，患者TBUT＞5～10 s或NIBUT为10～12 s，SⅠt（无麻醉）＞5～10 mm/5 min，则须采用荧光素钠染色法检查角结膜，染色阳性（≥5个点）可诊断干眼。（2）干眼严重程度诊断标准：①轻度：裂隙灯显微镜下检查无明显眼表损伤体征（角膜荧光素染色点＜5个），TBUT在2 s及以上。②中度：裂隙灯显微镜下检查角膜损伤范围不超过2个象限和（或）角膜荧光素染色点≥5个且＜30个，TBUT在2 s及以上。③重度：裂隙灯显微镜检查角膜损伤范围2个象限及以上和（或）角膜荧光染色点≥30个，TBUT＜2 s。角膜荧光素染点融合成粗点、片状或伴有丝状物。（3）年龄40～70岁。（4）眼压正常。（5）裂隙灯显微镜检查睑裂高度正常，无其他眼部病变。

排除标准：（1）长期角膜接触镜配戴史；（2）眼外伤、眼部手术及激光治疗史；（3）眼部其他疾病史：如翼状胬肉、圆锥角膜、眼部各种感染性和非感染性炎症、青光眼及眼底病病史；（4）眼部长期应用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素等眼部用药病史；（5）任何影响神经功能的全身性疾病和相关治疗史，如中枢神经系统疾病、颈椎或腰椎病、感染性疾病、糖尿病、肿瘤、甲状腺功能亢进、结缔组织病等。

选取2021年4—10月于山西省眼科医院门诊就诊的干眼症患者共91例（91眼），其中轻度干眼34例、中度干眼33 例、重度干眼24 例，同时征集正常健康志愿者作为对照组共27例（27眼）。所有对象均选择右眼为观察眼，所有检查按先非接触性、后接触性的检查顺序进行。本研究已获得山西省眼科医院医学伦理委员会批准（批号：sxyyll20210416）。在研究前获得所有对象的知情同意，并遵守赫尔辛基宣言的原则。

1.2 观察指标

常规检查：所有患者进行视力、眼压（NT-510，日本Nidek公司）、裂隙灯显微镜（BQ900，瑞士Haag-Streit公司）等常规检查，观察是否存在眼表炎症或者眼部其他疾病，所有检查均由同一人完成。

眼表综合分析仪检查：对所有患者右眼采用眼表综合分析仪（Keratograph 5M，德国Oculus公司）进行检查，观察患者泪河高度（Tear meniscus height，TMH）、NIBUT、脂质层分析、眼表充血评分、睑板腺分析、角膜荧光素钠染色（试纸条，中国辽宁美滋林药业有限公司）等指标，所有操作均由同一人完成。

IVCM 检查：通过海德堡Ⅱ代激光断层扫描系统（Heidelberg Retinal TomographⅡ，德国Heidelberg公司）的Rostock角膜模块组件完成。此组件主要由Rostock角膜显微镜、眼位监视CCD摄像头、Rostock角膜模块操作软件和外注视视标等组成，其激光波长为670 nm，放大倍数为800 倍，观察视野为400 µm×400 µm，扫描深度为1 500 µm，理论分辨率为1 µm。检查前于患者右眼滴入0.2%丙美卡因滴眼液（美国爱尔康公司）行表面麻醉，于IVCM镜头与角膜接触帽之间滴入卡波姆眼用凝胶（德国格哈德博士曼医药化工公司有限公司）作为耦合剂。移动物镜与患者角膜轻微接触，调节二者接触深度为0 μm，然后调节显微镜扫描深度直至查见角膜神经涡状结构，采集涡状结构周围2～3 mm区域的角膜SNP图像，共约200～400张。所有操作均由同一人完成。

1.3 图像处理与分析

图像处理：筛选和处理每例患者的角膜神经图像，排除其中聚焦欠佳、清晰度欠佳及神经结构残缺的图像，由同一位专业的计算机人员运用Photoshop CC 2018图像处理软件手动将多张图像的重叠区域对接，合成为1张大范围的角膜SNP结构拼图。拼接完成后由行IVCM检查的医师核实其准确性。

图像分析：分别在每张大范围拼图上截取以涡状结构为中心的、大小为700 μm×700 μm的图像进行进一步分析。运用Image J图像分析系统[10]，手动描绘拼图中神经纤维走行，结合软件自动追踪，可计算得出图像中神经纤维总长度（Nerve fiber length，NFL），单位为Pixel（见图1）。将所得数据通过图像大小0.49 mm2（即700 μm×700 μm）与像素之间的换算关系计算出单位面积（1 mm2）的神经纤维总长度值，即神经纤维密度值（mm/mm2）。

1.4 统计学方法

图1.干眼组及对照组角膜上皮基底细胞层下神经丛结构拼图Figure 1.Corneal subbasal epithelial nerve plexus structure puzzle of dry eye group and control group.

横断面研究。采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行分析。数据以表示。各组间年龄、性别、SNP密度值经验证为正态分布且方差齐，采用单因素方差分析进行比较，并对各组数据进行LSD多重比较。采用Pearson线性相关对变量进行相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本研究共纳入干眼症患者91 例（91 眼），其中轻度干眼组34 例，男15 例，女19 例，年龄41～65(51.9±6.9)岁；中度干眼组共33 例，其中男13 例，女20 例，年龄40～68(50.3±8.3)岁；重度干眼组共24 例，其中男10 例，女14 例，年龄41～67(49.9±8.8)岁。对照组共27 例（27 眼），其中男11 例，女16 例，年龄40～57(49.0±4.5)岁。4 组患者性别、年龄间比较差异均无统计学意义（F=0.05，P=0.984；F=0.85，P=0.468）。

对照组角膜SNP密度为（22.71±6.19）mm/mm2，轻度干眼组SNP密度为（28.58±5.19）mm/mm2，中度干眼组SNP密度为（28.17±4.71）mm/mm2，重度干眼组SNP密度为（5.98±7.32）mm/mm2，各组间角膜SNP密度比较差异有统计学意义（F=88.10，P＜0.001）。

轻、中、重度干眼角膜SNP密度与对照组间差异均有统计学意义（均P＜0.001），轻度干眼组与中度干眼组间差异无统计学意义（P=0.777），重度干眼组与轻、中度干眼组间差异有统计学意义（均P＜0.001）。这提示跟正常健康眼相比，干眼患者的角膜SNP密度发生了显著改变。在干眼早中期，角膜SNP密度并未减少反而相对增加，而重度干眼患者SNP密度则明显降低。见图2。

各组干眼患者角膜SNP密度与TMH、睑板腺缺失面积评分（上+下）及眼表充血评分之间无明显相关性（r=0.14，P=0.186；r=-0.13，P=0.228；r=-0.14，P=0.175），与NIBUT呈正相关（r=0.51，P＜0.001），与脂质层分级及角膜荧光素钠染色分级呈负相关（r=-0.30，P=0.004；r=-0.68，P＜0.001）。见图3。

图2.各干眼组与对照组角膜上皮基底细胞层下神经丛密度比较Figure 2.Comparison of corneal subbasal epithelial nerve density between dry eye group and control group.

3 讨论

干眼症作为一种生活中最常见的慢性眼表疾病之一，可由局部及全身多种因素引起。随着人们生活节奏加快、日常用眼过度和不规范的用眼习惯等，干眼症的发病率日益增加且呈年轻化趋势。有研究显示，干眼症在全球的发病率为5.5%～33.7%，其中我国为21%～30%[11]，严重影响了人们的生活质量与工作效率。而干眼症作为一种多因素疾病，发病原因复杂，除了眼表的炎症反应及组织损伤外，可同时伴有眼表神经的异常改变。

角膜是人体内神经分布最密集的组织之一，丰富的神经末梢使得角膜具有极高的敏感性。由于角膜无血管，角膜神经同时具有保护和营养双重功能。大多数角膜神经纤维起源于三叉神经的眼支，属于外周感觉神经，分布于角膜各层。神经束以平行于角膜表面的放射状方式进入角膜中基质层，进入角膜后不久，主要的基质束反复分支，逐渐上升到基质的更浅层，然后基质神经纤维突然转向90°，穿透Bowman层并向角膜表面移动，于Bowman层和上皮基底细胞层之间形成基底神经丛。该神经丛随后进一步形成分支，向上旋转，进入基底细胞之间的角膜上皮间，形成上皮内神经丛[9,12]。有研究证实，SNP在角膜顶点下方偏鼻侧的位置汇聚形成了角膜神经涡状结构，其位置比较固定，且易于辨认，常常作为角膜神经定位的理想标志[13]。而SNP神经纤维因为其分布密集且其分支广泛分布于角膜上皮细胞间等特点，对于角膜正常生理功能的维持起着不可忽视的作用。

现在的研究普遍认为，在干眼发病过程中，眼表泪液分泌系统（包括眼表上皮细胞、结膜杯状细胞、泪腺、副泪腺、睑板腺等）以及连接它们的神经结构中任何一个环节出现问题均可破坏眼表微环境，引起泪膜不稳定，从而导致干眼的发生[14]。目前国内外学者关于干眼患者角膜神经的变化进行了大量研究，多数研究认为干眼患者的角膜SNP形态和密度均发生了明显变化，但是关于其具体变化规律却颇具争议。Zhang等[4]通过对干燥综合征干眼组及非干燥综合征干眼组进行比较发现，随着干眼程度加重，干眼患者角膜SNP密度增高，分支明显增多及弯曲度增加，且在干燥综合征患者中此现象更为明显。Tuominen等[5]认为干燥综合征患者SNP密度和正常组相比无明显差异，但也存在着高度弯曲度及明显神经分支。Labbé等[6]通过对正常组、干眼组及青光眼组角膜SNP进行比较发现，与正常组相比，干眼和青光眼患者SNP密度和数量明显减少，但3组间在基底下神经宽度、神经串珠数量、弯曲度、反射率和分支数目等方面无明显差异。Cox等[7]研究发现，干眼患者总神经、主要神经、神经分支数量和神经密度较正常组明显降低，且与不同类型干眼症患者相关；同蒸发过强型干眼症相比，泪液不足型干眼症的这种降低更为显著。

图3.干眼患者眼表综合分析各指标与角膜上皮基底细胞层下神经丛密度相关性分析Figure 3.Correlation between ocular surface comprehensive analysis and corneal subbasal epithelial nerve density in patients with dry eye.

目前对于活体角膜神经的观察主要采用角膜共焦显微镜。共焦显微镜提供了一种可以直接观察角膜神经形态的无创操作方法，具有重复性高、易操作、更直观等优点，但同时受其观察范围小，定位功能差的条件限制，使用单张图片进行角膜神经定量分析的可靠性较差。因此，目前多数研究通过选取一定数量互不重叠的图像进行综合分析，但由于当前对于图片的选择标准并无统一定论，图片选择受主观性影响极大，容易产生选择误差，所以在运用此方法对角膜SNP进行定量分析的准确性也饱受质疑。而本研究通过构建角膜SNP结构拼图，可以更为直观地观察到范围约700 μm×700 μm的角膜神经形态，为进一步行角膜SNP定量分析提供更为可靠的方法，拼图法较传统的多张图片分析法的优越性已在本课题组前期的研究中[9]得到证实。

本研究发现，在干眼早期，角膜上皮基底神经丛密度较正常组增加，神经分支明显增多，走形迂曲，失去原有的平行及光滑螺旋状走形，这与Zhang等[4]和程燕等[8]的研究接近。在干眼发生过程中，泪液渗透压升高，眼表微环境发生改变，炎症反应加重，眼表上皮细胞的屏障功能受损，角膜神经末梢暴露，进一步可引起角膜神经的损伤，同时眼表炎症引起各种炎症因子（包括IL-1a、IL-1b、IL-6、TNF等）释放，这些炎症因子可以诱导多种神经营养因子（如NGF）的合成，刺激角膜神经再生(如神经芽、弯曲度的增加)[12]。在Tuominen等[5]的研究中，观察到大部分干燥综合征患者出现神经芽现象，提示神经正在活跃生长，本研究也在轻、中度干眼患者中发现了类似现象。目前多数研究认为这种角膜神经的异常形态学表现是由于干眼症患者的眼干引起的负反馈机制从而导致的神经芽状增生，这也通常被认为是角膜神经的退行性改变[5,15-17]，这些增生的神经纤维分支可能多数并不具备功能[18]。因此，Hosal等[18]研究发现虽然干眼症患者的角膜SNP数量明显增加，但其角膜中央的敏感度却显著下降。角膜神经的改变可能导致角膜感觉的降低，并可能与干眼症患者“症征分离”现象相关。随着干眼程度的加重，眼表炎症反应进一步加重，中度干眼患者中角膜SNP密度较轻度略有降低，但差异并无明显统计学意义，且可见较多Langhans细胞浸润。直至发展到重度干眼，各种炎症因子和促凋亡因子大量释放，眼表细胞凋亡通路激活，角膜上皮受损，角膜神经遭到破坏[8]。本研究发现重度干眼症患者角膜SNP密度较前明显降低，在共焦显微镜下甚至很少见到神经纤维，角膜神经连续性中断，部分神经变为短棒状，弯曲度也相对下降，这与程燕等[8]的研究结果相似。同时，我们观察到大量活化的Langhans细胞浸润，这也与多数研究结果[19-20]一致。Machetta等[19]通过比较干燥综合征患者和非干燥综合征患者角膜神经Langhans细胞密度发现，二者与正常组相比，其密度显著增加，这种改变在干燥综合征患者中更为显著，且Langhans细胞呈现出向心性迁移趋势，因此中央角膜比周边呈现出更高密度的Langhans细胞聚集，Xu等[20]也发现了类似结果。本研究中，干眼症患者各组间角膜SNP密度与NIBUT呈正相关，与脂质层分级及角膜荧光素钠染色分级呈明显负相关，这也进一步表明随着干眼程度的加重，角膜SNP密度呈现出逐渐减少的趋势。

干眼症是眼表常见的一种慢性疾病，对我们的生活质量影响极大，目前评估干眼症状和体征的检查方法多种多样，角膜共焦显微镜提供了一种无创的、直观的检查手段，可以帮助我们对干眼的角膜神经形态学改变及定量分析有更直观的了解，同时可以通过此方法评估干眼疾病的严重程度及治疗效果。本研究通过构建角膜SNP结构拼图证实了干眼患者早中期角膜SNP密度较正常组增加，随着疾病进展，干眼严重程度加重，炎症反应进一步加重，重度干眼患者的共焦显微镜图像中甚至少见神经纤维。干眼可引起角膜神经改变，同时角膜神经在稳态失衡时参与干眼的恶性循环，这可为干眼的神经营养治疗提供理论基础。Kheirkhah等[21]的研究也证实了角膜上皮基底神经丛NFL对干眼症患者治疗反应的影响，对于NFL无明显改变的患者，经过治疗后往往有着更好的疗效。

综上所述，角膜SNP的密度及形态改变与干眼症的严重程度分级有关，可作为临床评估干眼程度的有效指标。角膜共焦显微镜可在活体直接观察到角膜神经及其变化，可为干眼症的诊断和疗效评估提供依据。当然，本研究尚有部分不足，例如未按干眼类型分类进行研究，未对患者角膜知觉行量化分析并探究其与角膜SNP密度的相关性，观察样本量偏小等，未来仍需要进一步的大样本研究，为干眼个性化诊疗提供思路。

利益冲突申明 无任何利益冲突

作者贡献声明 高欢：收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；对编辑部的修改意见进行修改。于花、赵炬伟、宁晓玲、马骎、侯康：参与选题、设计和修改论文的结果、结论。郑晓汾：参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结果、结论，对编辑部的修改意见进行核修