一起藏绵羊溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌混合感染的实验室诊断

杨雪丽，程玉婷，汤 承，岳 华

（西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

目前，已证实能引起羊呼吸道疾病的常见病毒包括山羊副流感病毒3 型（CPIV3）、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）等；常见的细菌包括多杀性巴氏杆菌（Pm）、溶血性曼氏杆菌（Mh）；常见的支原体包括绵羊肺炎支原体（Mo）、丝状支原体簇成员（Mm Cluster）［1-4］。本研究对一起藏绵羊的呼吸道疾病进行病原确诊，以便针对性防治。

1 材料与方法

1.1 发病情况和临床症状 2021 年11 月，四川省甘孜州某藏绵羊养殖场一周内连续有21 只藏绵羊发病，其中死亡8 只，发病率为31%，致死率为38%。患病藏绵羊主要表现为精神不振、发热、咳嗽、流脓鼻涕、呼吸困难等呼吸道症状，部分出现腹泻症状。

1.2 样本处理 将养殖场送检的5 份患病藏绵羊深部鼻腔棉拭子浸入灭菌的5 mL PBS液中，涡旋混匀，分装保存于-80 ℃备用。

1.3 主要试剂和材料 RNAiso Plus 试剂、Prime ScriptTMRT反转录试剂盒、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2000、革兰氏染色液、血琼脂平皿，TSA琼脂培养基和TSB肉汤培养基。

1.4 核酸提取 从临床样本中分别提取DNA 和RNA。使用RNAiso Plus 提取棉拭子总RNA，并按照Prime ScriptTMRT 试剂盒说明书合成cDNA，用酚-氯仿法提取棉拭子总DNA。cDNA和DNA均于－20 ℃保存备用。

1.5 病原的PCR检测 采用文献报道的方法对CPIV3、BVDV、BCoV、Pm、Mh、Mo、Mm Cluster 进行PCR 检测，引物信息见表1。表1 引物送上海生工生物有限公司合成。

表1 引物信息

1.6 Pm 和Mh 的分离鉴定 对Pm 和Mh 的阳性样本进一步作细菌分离鉴定。将5 份Pm、Mh 阳性鼻拭子样本分别接种于含有10%小牛血清的TSB肉汤培养基中，在37 ℃摇床过夜培养16～24 h，增菌后接种于血琼脂平板上，37 ℃培养16～24 h。观察菌落的生长状况，挑取疑似单个菌落在血琼脂平板上纯化3次，进行革兰氏染色，镜检观察细菌形态，并对纯化后的细菌进行特异性PCR鉴定。

1.7 Mh 和Pm 的血清型鉴定 采用文献报道的PCR方法对分离菌进行血清型鉴定，引物信息和来源见表2。引物均送上海生工生物有限公司合成。

表2 分型引物序列信息

2 结果

2.1 PCR 检测结果 从5 份鼻拭子中均检出了Mh 和Pm，未检出其他病原。PCR 产物测序结果经Blast 比对，证实为Mh 和Pm 的目的片段（电泳图见图1和图2）。

图1 藏绵羊鼻拭子Mh的PCR检测结果

图2 藏绵羊鼻拭子Pm的PCR检测结果

2.2 细菌的分离鉴定结果 从5 份鼻拭子中分离得到5 株Pm 和Mh。Pm 在血琼脂培养基上培养24 h后，长出淡灰白色、露珠状半透明菌落，菌落表面光滑、湿润，无溶血环。镜检结果为革兰氏阴性菌，菌体两端钝圆，呈细小的短杆状或球杆状。经特异性PCR鉴定，确定分离菌为Pm。

Mh 在血琼脂培养基上培养18 h 长出露珠样大小、圆形、光滑的灰白色菌落，并伴有草绿色的溶血环。革兰氏染色后镜检可观察到单个或散在排列的革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆。经特异性PCR鉴定，确定分离菌为Mh。

2.3 Pm、Mh血清型鉴定结果 血清型鉴定结果显示，只有A2型引物从获得的5株Mh 中扩增出目的片段（图4），确定获得的5 株Mh 均为A2 型Mh；Pm 的A、B、D、E、F 血清型引物扩增结果显示，只有D 型引物从5 株Pm DNA 中扩增出目的条带（图5），确定分离到5株D型Pm。

图4 Mh的血清型鉴定结果

图5 Pm的血清型鉴定结果

3 讨论

3.1 羊感染Mh 情况 Mh 是反刍动物重要的呼吸道致病菌之一，可引起新生羔羊发生急性肺炎，Mh 根据荚膜抗原进行血清分型，共有12 个荚膜血清型（1、2、5～9、12～14、16 和17 型），从羊中最常检出1 型、2 型、6 型Mh［10］，国内羊群中最普遍的Mh 荚膜血清型是A2 型。目前尚无预防溶血性曼氏杆菌的相关疫苗，使用抗生素是治疗本病的主要手段，近年来Mh 耐药性的逐渐上升给Mh的治疗增加了难度。

3.2 羊感染Pm 情况 Pm 根据其荚膜抗原可分为A型、B型、D型、E型和F型5个血清型［11］，我国羊群中以荚膜A型、B型、D型为主。近年来D 型多杀性巴氏杆菌在国内羊群中流行较多。不同Pm 荚膜血清型之间交叉免疫保护性低，目前还没有针对D 型荚膜血清型Pm 的疫苗，有必要研制A、B、D型三价疫苗，为羊多杀性巴氏杆菌病的有效防控提供方便。

3.3 藏绵羊感染Mh、Pm 情况 不同羊群感染Pm 和Mh 的现象很普遍，但关于藏绵羊感染Mh、Pm的报道还很少。江金欢等［12］2017年从西藏山南市某地死亡的绵羊病料中分离出A2型溶血性曼氏杆菌；元振杰等［13］2018年从西藏日喀则市某发病羊场也分离到溶血性曼氏杆菌，且该分离株有很强的致病性；关于藏绵羊D型巴氏杆菌的报道仅有一篇［14］。

4 结论

结合临床症状和细菌分离培养鉴定结果，确定该养殖场藏绵羊发生的呼吸道疾病是由多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌混合感染引起的。进一步分型结果显示，Mh 为A2 型，Pm 为D型。■