原发性老年肝癌患者TACE前后miR-145、CD44变化及近期疗效

王朝英 徐军 罗靖茹 林海锋

(海南医学院第二附属医院肿瘤内科，海南 海口 570311)

原发性肝癌(PHC)是由肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，病死率较高，是我国常见的恶性肿瘤之一〔1〕。目前肝动脉化疗栓塞术(TACE)是临床上PHC中晚期患者，尤其是年老体弱无法耐受手术患者的首选治疗方法，该法可阻断肿瘤的血供，从而达到抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡的目的〔2〕。但肿瘤在TACE术后短期内的复发率较高，同时化疗药物和栓塞剂造成的血供不足会损伤患者的正常组织，并使肝纤维化程度增加，预后较差〔3〕。因此寻求安全有效的生物标志物对老年PHC患者TACE近期疗效进行预测，有利于临床针对患者病情情况展开进一步治疗。近年来研究〔4，5〕发现，微小RNA(miRNA)与细胞生长、发育、组织分化等密切相关，其中miR-145在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用，对肿瘤的发生发展起着重要的调节作用，同时miR-145可能对CD44的表达有调控作用，从而影响CD44阳性的肝癌细胞增殖。CD44是存在于多种细胞膜上的一种跨膜蛋白，作为肿瘤标志物之一，CD44与人类癌症及淋巴瘤细胞的浸润、转移有关，且CD44表达阳性的肿瘤细胞具有干细胞特征〔6〕。但目前miR-145、CD44在预测老年PHC患者TACE近期疗效方面的相关研究较少，故本研究通过分析TACE术前、术后老年PHC患者miR-145、CD44的表达情况，探讨了miR-145、CD44对TACE近期疗效的预测作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年2月至2021年5月于海南医学院第二附属医院接受TACE治疗的老年PHC患者110例。纳入标准：①PHC符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》〔7〕中的诊断标准，并经影像学检查、病理检查确诊；②既往无手术、放化疗、消融等治疗史，且首次行TACE；③肝功能Child-Pugh分级〔8〕为A、B级；④预计生存期>3个月；⑤美国东部肿瘤协作组(ECOG)体力状况评分〔9〕0～2分；⑥患者及其家属均已签署知情同意书。排除标准：①合并TACE禁忌证，包括明显腹水、肝癌体积>肝脏的70%、凝血功能障碍、门静脉高压伴中度以上胃底食管静脉曲张、碘过敏、动脉硬化、完全门静脉癌栓阻塞、严重肝硬化门静脉高；②无法完成选择性肝动脉插管者；③合并其他部位恶性肿瘤者或已发生淋巴结及远处转移；④合并代谢性疾病或心、肝、肾功能不全等严重器质性疾病。本研究在实施前已获得医院伦理批准。

1.2方法

1.2.1TACE治疗方法 患者取仰卧位，局部消毒麻醉后，采用Seldinger技术经皮穿刺股动脉(穿刺点为腹股沟韧带下1.0～1.5 cm股动脉搏动明显处)，以诊断性肝动脉造影明确肿瘤位置、数量、直径及供血情况，置入导管鞘，在X线透视及减影血管造影(DSA)造影的引导下，以导丝导管法选择性插管至肿瘤的供血动脉。化疗药物与适量超液化碘油(≤20 ml)充分混合后作为栓塞剂经导管缓慢注入，注射药物时间≥20 min，最后退出导管，局部加压包扎止血。术后进行常规镇痛、保肝、止吐、预防感染等治疗。

1.2.2miR-145的检测 采集患者TACE术前及术后3 d凌晨外周空腹肘静脉血3～5 ml，经3 000 r/min、4℃离心10 min后收集上层血清2 ml，加入Trizol总RNA提取剂(RNA快速提取试剂盒购自杭州昊鑫生物科技股份有限公司)，震荡混匀后室温静置5 min，加入0.2 ml氯仿，震荡静置后离心15 min，吸取上清至灭菌离心管中，加入0.5 ml异丙醇离心10 min，去上清，加入75%乙醇1 ml，混匀后离心5 min，去上清，空气干燥5～10 min，加入焦碳酸二乙酯水20 μl，混匀后分装，于-80℃冰箱保存待测。采用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)将样本总RNA逆转录为cDNA(RT-PCR试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司)，设计U6为内参基因(上海恒斐生物科技有限公司)，miR-145上游引物序列：5′-GCCATTAGCGCCAATTGGCAAT-3′，下游：5′-CTTAGGAATTTCCGAATCTGCC-3′；U6上游：5′-TGGCCATGGGTCTTCATAACTG-3′，下游：5′-GGCAATCCTAAGCGTTACCGA-3′。以实时定量PCR法检测miR-145，总反应体系为20 μl，反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性11 s，60℃退火28 s，共40个循环。miR-145的相对表达量以ΔCt值表示，ΔCt=CtmiR-145-CtU6。

1.2.3CD44的检测 采集患者TACE术前及术后3 d凌晨外周抗凝血2 ml，加等体积的0.9% NaCl溶液稀释，将稀释血液平铺到3 ml淋巴细胞分离液上，两液界面清晰，室温下离心(800 r/min)30 min后明显分层，吸取淋巴细胞层至洁净离心管，以0.9% NaCl溶液洗涤重悬后离心(250 r/min)10 min，弃上清，加10 ml细胞缓冲液，离心(350 r/min)5 min后弃上清液。计数活细胞以1×106个/ml重悬于细胞染色缓冲液中，于细胞体系内加入5 μl CD44-APC缀合抗体(美国Biolegend公司)，避光冰上15 min，离心(350 r/min)5 min，以2 ml细胞缓冲液洗涤2次。FACS Calibur流式细胞仪(美国Bector Dickinson公司)采集1×104个细胞，计算CD44阳性细胞比率。CD44阳性细胞(%)=(管内CD44阳性细胞数-对照抗体阳性细胞数)/10 000个肿瘤细胞×100%。

1.2.4疗效评价及分组〔10〕TACE治疗后3个月，根据改良实体瘤疗效评价标准(mRECIST)评估肝癌疗效，完全缓解(CR)：所有目标病灶动脉期无增强显影；部分缓解(PR)：目标病灶(动脉期增强显影)的直径总和缩小≥30%；进展(PD)：目标病灶(动脉期增强显影)的直径总和增加≥20%或出现新病灶；稳定(SD)：目标病灶的直径缩小总和未达PR或增加未达PD；客观缓解率(ORR)=(CR+PR)/总例数；临床获益率(CBR)=(CR+PR+SD)/总例数×100%。将CR、PR、SD患者纳入疗效良好组，PD患者纳入疗效不良组。

1.2.5收集可能影响TACE近期疗效的相关因素 收集患者的临床资料，包括性别、年龄、ECOG评分、Child-Pugh分级、临床分期〔11〕、乙型肝炎E抗原(HbeAg)状态、肿瘤部位、肿瘤直径、肿瘤数目、包膜完整性、超选择栓塞肿瘤供血支、门静脉癌栓、术中碘油用量、联合治疗方案(消融、放疗、分子靶向药物治疗)、化疗药物(5-氟尿嘧啶、表阿霉素、丝裂霉素)血清甲胎蛋白(AFP)水平、血清miR-145相对表达量、CD44阳性细胞比率。

1.3统计学方法 采用SPSS26.0软件进行t、χ2检验、Logistic回归分析，并绘制受试者工作特征(ROC)曲线，评估miR-145、CD44对老年PHC患者TACE近期疗效的预测效能，计算曲线下面积(AUC)值。

2 结 果

2.1TACE术前后miR-145、CD44的表达情况 与TACE术前比较，TACE术后患者miR-145相对表达量明显升高，CD44阳性细胞比率明显降低(均P<0.001)。见表1。

2.2TACE术后3个月的近期疗效 首次治疗3个月后，110例患者中CR 3例(2.73%)，PR 61例(55.45%)，PD 22例(20.00%)，SD 24例(21.82%)，ORR为58.18%(64/110)，CBR为80.00%(88/110)；疗效良好组88例，疗效不良组22例。

表1 TACE术前、术后miR-145、CD44的表达

2.3单因素分析可能影响患者TACE术后近期疗效的相关因素 与疗效良好组比较，疗效不良组包膜不完整、未超选择栓塞供血支、门静脉癌栓占比、肿瘤直径及TACE术后CD44阳性细胞比率明显升高，疗效不良组TACE术后miR-145相对表达量明显降低(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 可能影响患者TACE术后近期疗效的相关因素〔n(%)〕

2.4Logistic回归分析影响患者术后近期疗效的相关因素 TACE术后CD44阳性细胞比率、未超选择栓塞供血支及门静脉癌栓是影响老年PHC患者TACE近期疗效的危险因素，TACE术后miR-145相对表达量是影响老年PHC患者TACE近期疗效的保护因素(P<0.05)。见表3。

2.5ROC分析miR-145、CD44对老年PHC患者TACE近期疗效的预测作用 miR-145联合CD44预测老年PHC患者TACE近期疗效的灵敏度、准确度均高于miR-145、CD44单独预测。见表4、图1。

表3 Logistic回归分析影响患者术后近期疗效的相关因素

表4 ROC分析miR-145、CD44对老年PHC患者TACE近期疗效的预测作用

图1 miR-145、CD44预测老年PHC患者TACE近期疗效的ROC曲线

3 讨 论

目前临床上治疗PHC的非手术方法主要包括TACE术、放化疗、射频消融、微波等，其中TACE术以其疗效佳、耐受性高的特点被中晚期PHC患者尤其是老年患者所接受，广泛应用于PHC的治疗中〔12〕。TACE术主要通过栓塞肿瘤的供血动脉，使肿瘤组织缺血坏死，进而发挥抑制肿瘤生长的作用，但化疗栓塞后肿瘤易形成新的侧支循环，短期内易复发，影响临床疗效和转归，同时肝脏正常组织可由于栓塞剂和化疗药物的沉积而发生损伤，导致肝功能受损〔13，14〕。故此，采用合适的标志物预测老年PHC患者TACE术的近期疗效是临床治疗PHC的重点。

随着分子生物技术的发展，miRNA的多种生物学功能被逐渐发掘，其可通过调控细胞分化和凋亡直接参与肿瘤的发生和发展，同时miRNA在肿瘤中可以发挥促癌基因或抑癌基因的作用〔15〕。有研究〔16〕发现，miR-145在结直肠癌、肺癌、食管癌等多种肿瘤组织中存在差异性表达，且外周血miR-145的表达量与食管癌的近期疗效呈正相关。Zeng等〔17〕通过研究miR-145在胃癌中的作用机制发现，miR-145可靶向调控CD44的3′-非翻译区，从而在抑制肿瘤生长和化疗耐药中起关键作用。近年来研究〔18〕发现，CD44在人类恶性肿瘤组织中普遍存在，人类CD44基因位于11号染色体短臂，其作为跨膜蛋白可与胞外基质中的透明质酸、胶原、层黏连蛋白等基质分子结合，参与肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的黏附，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。胡榆雪等〔19〕一项荟萃分析提示，CD44阳性表达与肝癌患者预后密切相关。

本研究说明老年PHC患者TACE疗效较好，TACE术前、术后miR-145与CD44均有显著变化。邢爱丽等〔20〕分析影响大肝癌患者TACE疗效的相关因素发现，合并门静脉癌栓、肿瘤包膜不完整及肿瘤位于危险部位是影响治疗效果的独立危险因素。本研究Logistic回归分析结果表明TACE中未超选择栓塞供血支、存在门静脉癌栓及CD44阳性细胞比率高的患者，近期疗效较差，而miR-145相对表达量较高的患者，近期疗效较好。此外，ROC分析结果提示miR-145、CD44在老年PHC患者TACE近期疗效的预测中有重要意义，二者联合检测可作为临床预测TACE近期疗效的指标。