PRiME HLB-UPLC-MS/MS法测定祛痘类化妆品中9种磺胺类药物

许晓辉

兰州市食品药品检验检测研究院

王小乔*

兰州市食品药品检验检测研究院

赵波

兰州市食品药品检验检测研究院

朱仁愿

兰州市食品药品检验检测研究院

潘秀丽

兰州市食品药品检验检测研究院

面部痤疮也称为青春痘，是一种发生在毛囊皮脂腺及其周围组织的炎症病变，在年轻人中发生较为普遍，主要发生在面部。近年来，祛痘类化妆品的消费量逐年上升，许多化妆品企业推出了种类繁多的祛痘类产品，主要以硫磺、水杨酸、视黄醇棕榈酸酯、尿囊素等物质作为主要祛痘活性物质，或者采用中药（如丹参、苦参、甘草、黄芩和金银花等）提取物，从祛痘、预防、养肤等关键环节入手，使痤疮得到有效缓解[1]。磺胺类药物具有祛痘、抗粉刺、除螨等功效，一些不法商家为了提升祛痘类化妆品的功效，存在向产品中违法添加磺胺类药物的情况[2-8]，长时间使用含磺胺类药物的产品可导致其在人体内蓄积，易引起接触性皮炎、抗生素过敏等，还易产生耐药性，对人体产生危害。我国《化妆品安全技术规范（2015年版）》中明确规定了磺胺类药物为化妆品禁用组分。目前，对于化妆品中磺胺类药物检测方法，已经颁布的国家法定标准只有GB/T 24800.6-2009《化妆品中二十一种磺胺的测定 高效液相色谱法》，液质联用法的法定标准尚未发布。有关化妆品中磺胺类药物检测的常用前处理方法包括液液萃取和固相萃取等传统方法，这些检测方法和样品前处理方法均各具优势和缺陷[9-10]。近年来，PRiME HLB 固相萃取小柱因无需活化和平衡步骤，直接过滤即可有效去除蛋白质、磷脂和色素等干扰物质，已成为化妆品中违法添加物质检测净化的主要技术手段[11-12]，目前虽有高效液相色谱串联质谱法测定化妆品中磺胺类药物的相关文献报道[9-10]，但基于PRiME HLB 固相萃取小柱净化测定化妆品中磺胺类药物的检测方法文献报道还相对缺乏。为了判定祛痘类化妆品中磺胺类药物的使用风险，本研究采用饱和氯化钠溶液破乳，使用乙腈提取样品，以PRiME HLB 固相萃取小柱净化提取液，ACQUITY BEH C18 柱进行分离，基于超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-MS/MS）技术，建立了测定祛痘类化妆品中9 种磺胺类药物的检测方法，并应用于实际样品的快速筛查。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

标准物质：磺胺间甲氧嘧啶购自北京曼哈格生物科技有限公司；磺胺甲 唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺喹沙啉、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶购自中国食品药品检定研究院。甲酸、乙酸铵（色谱纯，东京化成工业株式会社）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；水为超纯水器自制超纯水；其他试剂为分析纯；PRiME HLB 固相萃取小柱（6cc，500mg，美国沃特世公司）。

实际检测祛痘类化妆品样品均随机购于化妆品专卖店，剂型为膏霜类、乳液类。

1.1.2 仪器

1290-6460 超高效液相色谱-三重四极杆液质联用仪（配有电喷雾离子源，美国安捷伦有限公司）；MS105DU 分析天平（瑞士梅特勒托利多）；SBL-10DT 超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Vortex-genie2 涡旋混合器（美国Scientific Industries 公司）；Milli-Q 超纯水器（美国Millipore公司）；5810R 离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY BEH C18 柱（1.7 μ m，2.1mm×100mm）；样品室温度：10 ℃；柱温：35 ℃；进样量：2μl；流速：0.3ml/min；流动相：A 为含0.1% 甲酸-2mmol/L 乙酸铵的水溶液，B 为含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱：0～2.0min，15%B；2.0～3.0min，25%B；3.0～4.0min，30%B ；4.0～5.0min，45%B ；5.0～7.0min，60%B；7.0～9.0min，90%B；9.0～10.0min，90%B；10.0～11.0 min，15%B ；11.0～12.0min，15%B。

1.2.2 质谱条件

离子源：正离子喷射流电喷雾离子源（AJS ESI）；扫描模式：多反应监测模式（MRM）；雾化气压力：45psi；气流速度：6L/min；气流温度：325 ℃；喷雾电压：500V；毛细管电压：4000V；鞘气流速：12L/min；鞘气温度：350℃；标准物质的母离子、子离子、碎裂电压及碰撞能量等质谱参数详见表1。

表1 标准物质的质谱测定条件

1.3 实验方法

1.3.1 对照溶液制备

精密称取磺胺类药物对照品各10.0mg，分别置于10ml 棕色容量瓶中，用乙腈溶解，并定容至刻度，配制成磺胺甲 唑、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹沙啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶浓度分别为 1.031、1.093、1.026、1.100、1.088、1.129、0.9831、1.094、1.129mg/ml的单一对照品溶液，然后分别准确吸取上述单一对照品溶液0.10ml，置同一100ml 棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，配制成各磺胺类药物浓度均约为 1μg/ml的混合对照品中间液；最后精密移取该混合对照品中间液1.00ml，置10ml 棕色容量瓶，用乙腈稀释并定容至刻度，配制成各药物浓度均约为0.1μg/ml的混合对照品溶液，置 4℃冷藏备用。

1.3.2 供试品溶液制备

准确称取样品0.5g 于50ml离心管中，加入10ml 饱和氯化钠溶液，放入陶瓷均质子，涡旋混合1min，然后准确加入乙腈10ml，涡旋混合1min，在300W 功率下超声提取5min，以3900r/min 离心10min，取上清液2ml 过PRiME HLB 固相萃取小柱，保持一秒一滴的流速，收集净化流出液，过0.22μm 有机相滤膜，作为供试品溶液，然后将供试品溶液转移至进样瓶中，进超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-MS/MS）测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件选择

本研究中考察的磺胺类药物属于中等极性物质，这些物质在甲醇和乙腈中具有良好的溶解性。液质联用仪流动相的有机相一般都为甲醇和乙腈，考虑到乙腈为中等极性溶剂，与大多数被测化合物极性接近，因此本研究选择乙腈作为提取溶剂。加入与提取溶剂等量的氯化钠饱和溶液分散破乳，同时，在高速离心作用下，饱和氯化钠溶液与乙腈分层，从而使被提取物质进入到有机层，干扰性杂质进入到水层。选择PRiME HLB 固相萃取小柱对提取液进行直接过滤式净化，为的是有效去除提取液中蛋白质、磷脂等非极性杂质，降低基质效应以增强质谱响应，同时该净化方法直接过滤净化，无需进行活化、清洗和洗脱等传统固相萃取步骤，简化了前处理流程，节约了时间。

2.2 色谱条件优化

本研究中考察的磺胺类药物属于中等极性物质，因此，选择了适用于中等极性物质通用的ACQUITY BEH C18 超高效色谱柱。在正离子模式下，在流动相中添加甲酸能够提高目标化合物的离子化效率，添加乙酸铵能够稳定水相和改善峰型。因此，本研究中在水相中加入0.1%甲酸和2mmol/L 乙酸铵显著改善了峰型、提高了灵敏度，在有机相中加入0.1%甲酸稳定了保留时间，提高了重复性。

2.3 质谱条件优化

本研究将被检测的磺胺类药物分别配制成单个标准溶液，在正离子模式下，直接注入质谱仪，进行全扫描（Scan），确定母离子后，进行选择性离子扫描（SIM），确定碎裂电压，其次进行子离子扫描（Pro），选取丰度最高且相对稳定的2 个碎片离子分别作为定性离子和定量离子，其中以峰型好、干扰小、信噪比高的离子对作为定量离子对，最后利用MassHunter 采集软件及定性软件，同时优化定性和定量离子的碰撞能量参数，建立MRM 方法。

2.4 9 种磺胺类药物的总离子流图

以MRM 模式测定9 种磺胺类药物的定性和定量离子对色谱图，共有18 个离子监测通道。图1为浓度为10ng/ml的混合标准品的总离子流图，由图1可见，各个物质响应良好，峰形对称，定量准确可靠。

图1 9 种磺胺类药物MRM 总离子流图

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系、检出限、定量下限

精密移取混合对照品溶液适量，用乙腈-水（20 ∶80，体积比）稀释配制成质量浓度分别为0、2、5、10、20、40、60 ng/ml的系列标准曲线溶液，外标法定量。在优化的实验条件下，以待测物的峰面积（y）为纵坐标，以其质量浓度（x，ng/ml）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，各物质在0～60ng/ml 范围内呈良好线性关系，相关系数（R2）大于0.9959。将混合对照品溶液加入空白基质中，加标浓度逐级递减，按 “1.3.2” 进行样品前处理，以 3 倍信噪比时计算检出限（LOD），10 倍信噪比时计算定量下限（LOQ）。结果显示，LOD在0.0171～1.222μg/kg 范围，LOQ 在0.0543～4.400μg/kg范围，结果详见表2。

表2 9 种磺胺类药物的线性关系、检出限、定量下限、回收率及RSD（n=6）

续表

2.5.2 回收率与相对标准偏差

在优化的实验条件下，对阴性样品进行3 个浓度水平的加标回收实验，加入的混合对照品中间液含量分别为100、200、400μg/kg，每个含量水平平行制备6 份样品，每份样品重复测定3 次，经提取净化后进行测定，外标法定量，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD）。结果显示，9 种磺胺类药物的平均回收率为 62.4%～89.4%，RSD为2.3%～9.4%，结果详见表2。结果表明，该方法的准确度良好，符合定量检测要求。

2.6 实际样品筛查

应用本法对市售的15 批祛痘类化妆品中9 种磺胺类药物进行检测，结果显示均未检出。

3 结论

PRiME HLB 固相萃取小柱可以吸附样品中非极性干扰物而不影响任务目标物的回收率，特别是对于造成基质干扰的脂肪和磷脂，去除效率效果良好，可以达到用最简单的过滤式样品制备流程实现最洁净样品净化的目标。本文采用饱和氯化钠溶液分散破乳样品，然后加入乙腈进行提取，在离心作用下，饱和氯化钠溶液和乙腈溶液分层，乙腈层处于上层，上层溶液直接过PRiME HLB 固相萃取小柱净化，UPLC-MS/MS 法检测，外标法定量，实现了对祛痘类化妆品中磺胺类药物的快速测定。实验表明该方法前处理操作简单、耗时短、抗干扰能力强，能够满足祛痘类化妆品中违法添加9 种磺胺类药物的快速检测需求。